改性的PHBV膜與大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的相容性.pdf

1、實驗目的：
　　 組織工程學是應用生物學和工程學的原理研究開發(fā)能夠修復、重建或改善病損組織形態(tài)和功能的生物替代物的一門學科。目前，應用組織工程方法已經(jīng)制備出人工骨、軟骨、皮膚、肌腱、血管甚至人工胰、人工肝等。我國骨組織工程研究進展較快，已經(jīng)利用組織工程化骨修復顱骨缺損獲得成功。骨再生的形狀與數(shù)量與骨膜下空間有關，是骨組織再生的重要問題之一。此外，在骨組織工程研究中還存在許多難題，理想的細胞外基質(zhì)材料的選擇和制備是骨組織工程中十分

2、重要的任務，也是組織工程化骨組織能否應用于臨床的重要影響因素。
　　 理想的骨組織工程細胞外基質(zhì)材料應具備:1.良好的生物相容性:除無毒、不致畸和致癌之外，還要有利于種子細胞的黏附、增殖和降解產(chǎn)物能及時排除，利于種子細胞的融合生長，無炎癥反應，不抑制細胞的生長和分化。2.良好的生物降解性:基質(zhì)材料在完成支架作用后應能降解，降解率應與組織細胞生長率相匹配，降解時間應能根據(jù)組織生長特性可以進行人工調(diào)控。3.具有三維立體多孔結構:基質(zhì)

3、材料可加工成三維立體結構，孔隙率最好達90％以上，具有較高的面積體積比。這種結構可提供寬大的表面積和空間，利于細胞黏附，細胞外基質(zhì)沉積，營養(yǎng)和氧氣進入，代謝產(chǎn)物排出和細胞的生長。4.可塑性和機械強度:基質(zhì)材料應具有良好的可塑性，可預先制作成一定形狀，并具有一定的機械強度，為新生組織提供支撐，并能保持一定長度的時間，直至新生組織具有自身生物力學特性。5.良好的材料-細胞界面:材料應能提供良好的材料細胞融合作用界面，利于細胞黏附、生長，更重

4、要的是材料應能激活細胞特異基因表達，維持正常細胞的表型表達。
　　 人工合成高分子材料具有良好的可降解吸收性，同時其組成和結構、機械性能以及材料的降解時間等都能預先設計和調(diào)控，因此是組織工程材料中研究最多、應用最廣的支架材料。PHBV生物可降解高分子材料的應用是生物醫(yī)學工程材料的重大進展。因其具備良好的生物相容性、完全的生物可降解性、穩(wěn)定的壓電特性，目前研究已證明PHBV可用于藥物緩釋載體、組織工程支架材料、構建心臟生物瓣膜、引

5、導膜再生骨和手術縫合線等。
　　 但是PHBV的脆性仍然很大，原因在于它的純度較高，球晶尺寸較大。對于PHBV來說，當HV摩爾含量較低時(≤0.12)，它的斷裂伸長率只有6％左右，在拉伸條件下能成晶和流動。由于PHB和PHBV的高純度，結晶成核密度比較低，室溫下能夠二次結晶，結晶度比較高，結晶速度比較慢易生成大尺寸的球晶。以球晶中心向外擴展形成許多圓環(huán)狀的開裂以及沿球晶生長方向形成許多劈裂，從而導致了PHBV呈脆性斷裂。另外，P

6、HBV的機械性能差，骨結合力弱更是需要解決的問題。進一步提高PHBV共聚物的生物相容性并增強其耐腐蝕性能，使其能夠作為骨損傷后的固定材料和骨組織工程的支架材料，是本實驗研究的主要問題。
　　 通過探索溶解在PHBV中的不同濃度的3-(4-羥基-3-甲氧苯基)-2-丙烯酸對于骨髓間充質(zhì)干細胞的生長增殖作用，制備出具有最佳濃度的3-(4-羥基-3-甲氧苯基)-2-丙烯酸PHBV，構建成具有立體化的三維組織工程支架，在體外將其與骨髓間

7、充質(zhì)干細胞進行共培養(yǎng)，檢測骨髓間充質(zhì)干細胞的形態(tài)變化、細胞活力、細胞周期等各項指標，以探討表面改性的PHBV膜與骨髓間充質(zhì)干細胞融合的新型人造膜狀組織替代物的可行性。為臨床應用提供實驗依據(jù)。
　　 實驗方法：
　　 SPF級健康成年SD大鼠(100-120g)，頸椎離斷處死，全骨髓培養(yǎng)法分離出均質(zhì)的骨髓間充質(zhì)干細胞。將第三代細胞離心，流式細胞儀檢測細胞表面cd34、cd44、cd90、cd11b抗原并進行鑒定。PHBV與

8、甲苯攪拌均勻，用注射器抽取成膜液注入直徑9cm的玻璃培養(yǎng)皿，真空干燥機室溫下干燥成厚度為0.5mm的薄膜。將其分為4組，分別是:0％阿魏酸處理組、5％阿魏酸處理組、10％阿魏酸處理組、15％阿魏酸處理組。將骨髓間充質(zhì)干細胞與改性的PHBV膜復合培養(yǎng)，用掃描電鏡觀察材料表面細胞的微細結構形態(tài)變化。制備浸提液，用浸提液培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞，用倒置顯微鏡觀察細胞生長狀態(tài)、細胞活力檢測（MTT法）、細胞周期檢測等多種方法，綜合分析骨髓間充質(zhì)干細

9、胞與經(jīng)阿魏酸處理的PHBV膜的體外組織相容性。
　　 實驗結果：
　　 經(jīng)過原代培養(yǎng)5d后，骨髓間充質(zhì)干細胞融合成單層。倒置顯微鏡觀察，見骨髓間充質(zhì)干細胞呈梭形貼壁生長，大小均勻，大量生長時細胞排列呈漩渦狀。接觸抑制現(xiàn)象不明顯，呈現(xiàn)出常見的骨髓間充質(zhì)干細胞特征。流式細胞儀表型分析結果，所獲得的BMSCs均質(zhì)性好，低表達淋巴細胞表面標志CD11b、造血干細胞表面標志CD34;高表達間充質(zhì)干細胞表面標志CD44、CD90。<

10、br>　　 掃描電鏡觀察可見:PHBV膜的材料表面結構平整，有利于細胞生長。分別與骨髓間充質(zhì)干細胞復合培養(yǎng)6h、12h、24h后，在各組材料表面均有細胞黏附，細胞呈梭形或多角形，伸出偽足黏附于材料上。其中，0％和5％阿魏酸處理的材料表面的細胞呈跨越生長，并覆蓋材料表面孔隙生長，細胞連接增多，細胞表面有微絨毛出現(xiàn)，說明細胞生長狀態(tài)良好。而10％和15％阿魏酸處理組材料表面細胞數(shù)量較稀疏，生長的偽足不明顯。
　　 細胞活力檢測結果

11、顯示:PHBV組和各對照組的吸光度值都隨時間延長而逐漸升高(P＜0.05)。5％阿魏酸處理的材料的吸光度值高于其他各組(P＜0.05)，陰性對照組的吸光度值低于其他各組(P＜0.05)。
　　 細胞周期法檢測結果顯示:PHBV組和各對比組的細胞增殖指數(shù)，即（S期+G2期）百分比均隨時間延長而逐漸增高(p＜0.05)。5％阿魏酸處理的細胞增殖指數(shù)高于其他各組(p＜0.05)，PLA陰性對照組的細胞增殖指數(shù)低于其他各組(p＜0.05