PBMSCs移植治療兔ONFH的體內(nèi)存活及局部微環(huán)境細(xì)胞因子表達(dá)研究.pdf

1、目的:本課題是在課題組既往研究已證實(shí)原位移植兔外周血間充質(zhì)干細(xì)胞(PBMSCs)對于液氮冷凍兔股骨頭壞死模型具有治療效應(yīng)的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步提供移植 PBMSCs的體內(nèi)定植與存活情況以及移植后股骨頭病損區(qū)域以細(xì)胞因子為主的內(nèi)環(huán)境改變情況,為闡明PBMSCs移植治療股骨頭壞死的可能機(jī)制提供新的有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:①兔PBMSCs的分離、培養(yǎng)與表型鑒定:選用2~3月齡日本大耳白兔,按30μg/(kg·d)劑量連續(xù)于背部皮下注射G

2、-CSF動(dòng)員6 d,第7 d自主動(dòng)脈取兔外周血40 ml,采用密度梯度離心法分離出單個(gè)核細(xì)胞,用紅細(xì)胞裂解液清除混入的紅細(xì)胞,用含15％FBS的改良型α-MEM,于37oC、5%CO2飽和濕度環(huán)境下進(jìn)行PBMSCs原代培養(yǎng),適時(shí)換液并棄除未貼壁的其他細(xì)胞,待貼壁細(xì)胞生長匯合度達(dá)80%~90%時(shí),按2~5×105/ml細(xì)胞密度進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取第2代細(xì)胞,以免疫細(xì)胞化學(xué)染色法對分離培養(yǎng)的兔PBMSCs進(jìn)行CD90、CD105、CD44、CD

3、34、CD45表型鑒定。
　?、谕霉晒穷^壞死模型的制備:采用3~4月齡日本大耳白兔,使用3%戊巴比妥鈉耳緣靜脈注射麻醉動(dòng)物(劑量為30 mg/kg),無菌條件下手術(shù)逐層鈍性分離臀肌以暴露股骨頭;無菌棉簽蘸取液氮,對股骨頭軟骨面負(fù)重區(qū)進(jìn)行反復(fù)冷凍、復(fù)溫以制備股骨頭壞死模型。
　　③動(dòng)物分組與細(xì)胞移植:實(shí)驗(yàn)分為正常對照組、模型組、髓芯減壓組和髓芯減壓+PBMSCs移植組。液氮冷凍后,用直徑1.2 mm鉆頭從髓芯減壓組和細(xì)胞移植組

4、兩組動(dòng)物股骨頸的內(nèi)后側(cè)與股骨頸方向呈30度角手動(dòng)鉆入股骨頭內(nèi)5 mm,到達(dá)關(guān)節(jié)軟骨下,髓芯減壓組在鉆孔后即復(fù)位股骨頭;細(xì)胞移植組鉆孔后,自減壓孔注射入以300μl生理鹽水懸浮的第2~3代PBMSCs(細(xì)胞數(shù)為3~4×106個(gè));術(shù)后逐層縫合各組動(dòng)物創(chuàng)口。移植PKH26標(biāo)記的PBMSCs的體內(nèi)定植示蹤及股骨頭組織損傷區(qū)域的組織病理學(xué)觀察:于術(shù)后2 w、4 w、6 w、8 w隨機(jī)選取各時(shí)間點(diǎn)各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物股骨頭,沿冠狀面剖開股骨頭,進(jìn)行固定、

5、脫鈣,制作冰凍切片(厚15μm)及常規(guī)石蠟切片(厚10μm),將冰凍切片DAPI復(fù)染后,置熒光顯微鏡下觀察移植細(xì)胞存活情況,石蠟切片經(jīng)Masson染色,置光鏡下觀察組織病理學(xué)變化情況。
　　④移植PBMSCs后股骨頭局部細(xì)胞因子表-達(dá)的內(nèi)環(huán)境變化:將部分股骨頭樣本置于液氮中保存,用于實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR),以檢測不同時(shí)間點(diǎn)各組股骨頭內(nèi)BMP-2、BMP-4、PDGF-β、TGF-β1、VEGF-A及CCL2 mRNA的表

6、達(dá)情況。
　　結(jié)果:①家兔PBMSCs培養(yǎng)形態(tài)與表型特征:原代培養(yǎng)第5 d時(shí),可見較多貼壁細(xì)胞,細(xì)胞呈梭形、多角形及不規(guī)則形,以梭形為主,可達(dá)20%~30%融合率,培養(yǎng)到10 d左右時(shí),細(xì)胞生長匯合度達(dá)80%以上;傳代培養(yǎng)的PBMSCs形態(tài)均一,呈梭形漩渦狀生長。免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示,PBMSCs表達(dá)CD90、CD105、CD44,不表達(dá)CD34、CD45。
　　②移植PKH26標(biāo)記的PBMSCs的體內(nèi)定植及存活分析:熒

7、光顯微鏡下的觀察結(jié)果顯示移植PKH26標(biāo)記的PBMSCs移植后第2 w、4 w、6 w、8 w兔股骨頭移植部位均存在 PKH26標(biāo)記的陽性移植細(xì)胞,且隨時(shí)間點(diǎn)的推移,移植PBMSCs定植存活細(xì)胞的數(shù)量逐漸減少。
　?、弁霉晒穷^的Masson染色組織病理學(xué)分析:鏡下可見正常組軟骨下區(qū)域的骨小梁完整,排列規(guī)律,大部分為紅染的成熟骨組織;2 w時(shí)模型組骨小梁斷裂,排列紊亂,大部分為綠染的新生骨組織,骨小梁中骨細(xì)胞空骨陷窩增多,髓芯減壓組

8、與移植組也可見被染上綠色的骨小梁;4 w時(shí)模型組骨小梁較細(xì),綠染不均勻,新生骨質(zhì)開始增加,髓芯減壓組與移植組部分骨小梁呈現(xiàn)較均勻綠染并出現(xiàn)片狀紅染;6 w時(shí)模型組股骨頭軟骨下區(qū)域的骨小梁大部分為綠染的新生骨組織,髓芯減壓組與移植組可見條狀綠染的骨小梁;8 w時(shí)模型組紅染的成熟骨組織區(qū)域增大,骨小梁稀疏,軟骨下的骨質(zhì)比較薄,髓芯減壓組紅染區(qū)域擴(kuò)大,骨小梁稀疏,骨質(zhì)比較薄,移植組骨小梁呈現(xiàn)紅綠相間,骨小梁較另兩組密集,其間點(diǎn)狀紅染區(qū)域與綠染

9、區(qū)域相間分布。
　?、芄晒穷^局部組織細(xì)胞因子表達(dá)的RT-PCR檢測結(jié)果:模型組各觀察時(shí)間點(diǎn)股骨頭內(nèi)BMP-2 mRNA的表達(dá)量均明顯低于正常組(P<0.01);細(xì)胞移植組各觀察時(shí)間點(diǎn)股骨頭內(nèi)BMP-2 mRNA的表達(dá)量均高于模型組(P<0.01或P<0.05),細(xì)胞移植組股骨頭內(nèi)BMP-2 mRNA的表達(dá)量與髓芯減壓組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;模型組各觀察時(shí)間點(diǎn)股骨頭內(nèi)BMP-4 mRNA的表達(dá)量均明顯低于正常組(P<0.01),細(xì)胞移植

10、組各觀察時(shí)間點(diǎn)股骨頭內(nèi)BMP-4 mRNA的表達(dá)量均高于模型組(P<0.01或P<0.05),細(xì)胞移植組股骨頭內(nèi)BMP-4 mRNA的表達(dá)量在2 w時(shí)高于髓芯減壓組(P<0.05),隨著時(shí)間的推移,細(xì)胞移植組BMP-4 mRNA的表達(dá)量4 w、6 w、8 w呈現(xiàn)出升高后降低的變化(P<0.05);模型組各觀察時(shí)間點(diǎn)股骨頭內(nèi)PDGF-βmRNA的表達(dá)量均低于正常組(P<0.05或P<0.01),細(xì)胞移植組在各觀察時(shí)間點(diǎn)時(shí)股骨頭內(nèi)PDGF-

11、β mRNA的表達(dá)量均明顯高于模型組(P<0.01),細(xì)胞移植組股骨頭內(nèi)PDGF-β mRNA的表達(dá)量在4 w、8 w時(shí)高于髓芯減壓組(P<0.05);模型組各觀察時(shí)間點(diǎn)股骨頭內(nèi)TGF-β1 mRNA的表達(dá)量均明顯低于正常組(P<0.01),細(xì)胞移植組在各觀察時(shí)間點(diǎn)股骨頭內(nèi)TGF-β1 mRNA的表達(dá)量均顯著高于模型組(P<0.01),細(xì)胞移植組股骨頭內(nèi)TGF-β1 mRNA的表達(dá)量在8 w時(shí)高于髓芯減壓組(P<0.05)隨著時(shí)間的推移

12、,細(xì)胞移植組TGF-β1 mRNA在2 w、4 w時(shí)的表達(dá)量均呈現(xiàn)出升高的變化(P<0.05);模型組各觀察時(shí)間點(diǎn)股骨頭內(nèi)VEGF-A mRNA的表達(dá)量均明顯低于正常組(P<0.01),細(xì)胞移植組在各觀察時(shí)間點(diǎn)股骨頭內(nèi)VEGF-A mRNA的表達(dá)量均高于模型組(P<0.05或P<0.01),其中6w、8 w時(shí)髓芯減壓組股骨頭內(nèi)VEGF-A mRNA的表達(dá)量明顯均高于模型組(P<0.01),細(xì)胞移植組股骨頭內(nèi)VEGF-A mRNA的表達(dá)量

13、與髓芯減壓組沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;模型組各觀察時(shí)間點(diǎn)股骨頭內(nèi)CCL2 mRNA的表達(dá)量均高于正常組(P<0.05),細(xì)胞移植組在各觀察時(shí)間點(diǎn)股骨頭內(nèi)CCL2 mRNA的表達(dá)量均明顯低于模型組(P<0.01),細(xì)胞移植組股骨頭內(nèi)CCL2 mRNA的表達(dá)量在各觀察時(shí)間點(diǎn)均低于髓芯減壓組(P<0.05或P<0.01)。
　　結(jié)論:移植的兔PBMSCs能夠在兔股骨頭壞死的原位組織中定植存活至少8 w。移植 PBMSCs所發(fā)揮的股骨頭壞死修復(fù)作用