人睪丸組織高表達(dá)Rhomboid成員RHBDD1在腫瘤發(fā)生和細(xì)胞非經(jīng)典通路分泌中的功能研究.pdf

1、RHBDD1是本科室從睪丸抑制性消減雜交文庫中篩選出的一個在睪丸組織中高表達(dá)的新基因。本基因在人中表達(dá)全長為315aa,其1—24aa預(yù)測為一個可以被切割的信號肽序列,可能參與介導(dǎo)蛋白的定位,本蛋白含有四個跨膜結(jié)構(gòu)域,在其215—315aa之間為一段高度親水性的區(qū)域。蛋白結(jié)構(gòu)域分析表明,在其61-214aa含有一個高度保守的Rhomboid結(jié)構(gòu)域,故本蛋白屬于Rhomboid蛋白酶家族。
　　 首先,利用從臨床腫瘤中獲得的乳腺癌

2、和結(jié)直腸癌樣品中,免疫印跡分析發(fā)現(xiàn)RHBDD1在腫瘤組織中有明顯的高表達(dá),而且在乳腺癌樣品中發(fā)蜆RHBDD1的表達(dá)和腫瘤的惡性程度存在一定的關(guān)聯(lián):在惡性程度高的腫瘤樣品中RHBDD1存在最高表達(dá),中度惡性腫瘤樣品表達(dá)較低,低惡性腫瘤樣品表達(dá)最低。在結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT116中利用RHBDD1 RNAi慢病毒干擾內(nèi)源性RHBDD1的表達(dá)發(fā)現(xiàn),RHBDD1干擾之后細(xì)胞的增值速率明顯降低,細(xì)胞集落形成能力明顯降低并且細(xì)胞周期在G1/S檢驗點(diǎn)存

3、在明顯的阻遏。利用熒光素酶報告基因?qū)嶒灠l(fā)現(xiàn)RHBDD1可以特異性地激活A(yù)P-1熒光素酶報告基因載體,而其RHBDD1S144A酶活性缺失突變體則沒有激活活性。
　　 酵母雙雜交實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),RHBDD1可能與促凋亡蛋白TSAP6存在相互作用,免疫共沉淀實驗也進(jìn)一步證明了這兩個蛋白質(zhì)之間的相互作用。TSAP6是一個含488aa的參與細(xì)胞分泌和凋亡的蛋白,含有6個跨膜結(jié)構(gòu)域,免疫印跡檢測為55-70KD的雙帶型蛋白,文獻(xiàn)報道其分子量

4、較大的條帶為糖基化修飾的蛋白。在兩者共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞條件下,發(fā)現(xiàn)TSAP6的55-70KD條帶出現(xiàn)減弱,并且在38KD出現(xiàn)一個新的蛋白條帶。由于RHBDD1是蛋白酶,故推測TSAP6可能為RHBDD1的底物蛋白。兩者共轉(zhuǎn)染TSAP6上面的雙帶出現(xiàn)減弱,并且出現(xiàn)38KD的條帶,而共轉(zhuǎn)染TSAP6和RHBDD1-S144A則無切割。TSAP6條帶的切割也隨RHBDD1劑量的增加而增加。
　　 實驗發(fā)現(xiàn)RHBDD1對TSAP6有至少

5、三個切割位點(diǎn),分別對應(yīng)于TSAP6的第一、第二和第三跨膜結(jié)構(gòu)域,并且其切割受切割位點(diǎn)附近氨基酸保守性的影響。免疫熒光實驗結(jié)果顯示,RHBDD1主要定位于細(xì)胞膜,少量存在于胞漿內(nèi),而TSAP6主要定位于胞漿中,兩者共定位存在一定的位置關(guān)聯(lián)性。采用宋偉博士利用細(xì)胞系Knock-in技術(shù)制作的內(nèi)源性RHBDD1 G142A—S144A突變的HCT116細(xì)胞系(RHBDD1-mt)進(jìn)行實驗表明,RHBDD1-mt細(xì)胞的exosome分泌有明顯的

6、升高。并且,在RHBDD1-mt細(xì)胞分泌的exosme中exosome標(biāo)志蛋白Tsg101和Tf-R也有明顯的升高。利用蔗糖密度梯度超速離心實驗驗證exosome組分表明,Tsg101和Tf-R確實位于exosme之中。同時,RHBDD1-mt細(xì)胞所分泌的exosome樣品中FasL和Trail分子的量也有升高,并可以促進(jìn)這些exosome誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡的能力。這些工作充分說明了RHBDD1可以通過切割TSAP6調(diào)節(jié)exoso

7、me的分泌,從而影響exosome介導(dǎo)的生物學(xué)功能,影響機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)。
　　 此外,從德國GGTC中心購置了RHBDD1 gene-Trap小鼠胚胎干細(xì)胞系A(chǔ)049C04和W087D06,并委托中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所張連峰教授課題組制作了RHBDD1 gene-Trap小鼠。A049C04獲得了gene-Trap小鼠,W087D06干細(xì)胞制作gene-Trap未成功。生理觀察和HE染色未發(fā)現(xiàn)A049C04制作的gene-

8、trap小鼠有生理異常。采用X-gal染色小鼠組織冰凍切片發(fā)現(xiàn),RHBDD1在多種組織中具有廣泛的表達(dá)。在腦組織中,RHBDD1在小腦皮層蒲傾野氏細(xì)胞中有特異性高表達(dá),并且在大腦神經(jīng)元細(xì)胞中有廣泛表達(dá)。在小腸絨毛上皮中,RHBDD1特異性地在小腸絨毛的基底細(xì)胞中特異性高表達(dá)。在睪丸組織中,RHBDD1在間質(zhì)細(xì)胞中有異常的高表達(dá),在精原細(xì)胞中也有高表達(dá),精母細(xì)胞和各類精子細(xì)胞中表達(dá)量低。
　　 此外,在原核細(xì)胞中表達(dá)His標(biāo)簽標(biāo)記