Annexin Ⅱ受體介導(dǎo)細胞凋亡的研究Tmed2促進小鼠前成骨細胞增殖的研究.pdf

1、我的工作主要包含兩部分內(nèi)容：
　　 一、AnnexinⅡ受體介導(dǎo)細胞凋亡的研究
　　 隨著人們對凋亡的認識逐漸深入，對凋亡發(fā)生的分子機制的了解也越來越透徹，但同時也發(fā)現(xiàn)這一過程遠非原來想象的那樣簡單，而是包含了復(fù)雜的調(diào)控機制。盡管近幾年在凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、凋亡的生化反應(yīng)機制以及凋亡的基因調(diào)控等方面的研究都取得了顯著的進展，但仍有許多問題迄今尚未闡明。
　　 本文的研究對象人類鈣磷脂結(jié)合蛋白Ⅱ受體humanAnne

2、xinⅡreceptor(簡稱AXIIR)，又稱為C50rf39，是一個具有193個氨基酸的蛋白質(zhì)，其編碼基因位于人類染色體5p12區(qū)。通過基因序列比對和PCR檢測認為AXIIR僅存在于人類第5號染色體上而不存在于其他種屬，是人類所特有的基因。AXIIR最先是在2006年，研究者從人類骨髓cDNA文庫中尋找AnnexinⅡ的受體時被克隆出來的，推測為Ⅰ型膜蛋白，研究認為AXIIR表達在骨髓基質(zhì)細胞的表面，介導(dǎo)AnnexinⅡ的信號傳導(dǎo)而

3、促進成骨細胞形成。而隨后對于該基因的功能研究結(jié)果也僅僅是認為其作為AnnexinⅡ的細胞膜受體來介導(dǎo)AnnexinⅡ的信號傳遞。該基因的功能研究還處于早期階段，更沒有任何證據(jù)證明其與細胞凋亡相關(guān)。
　　 AnnexinⅡ是鈣磷脂結(jié)合蛋白(Annexin)家族中的一個重要成員，存在于細胞膜、胞質(zhì)和胞外。AnnexinⅡ具有廣泛的功能，AnnexinⅡ與一系列細胞外基質(zhì)成分相互作用，參與許多細胞膜相關(guān)事件，如細胞外吐和內(nèi)吞，細胞黏附

4、，纖溶酶原激活，腫瘤遷移和侵襲。
　　 在本研究中，首先通過在人髓性白血病K562細胞系中過表達AXIIR基因，確證該基因高表達時能夠誘導(dǎo)細胞凋亡。進一步發(fā)現(xiàn)AXIIR能引起其他人類細胞發(fā)生不同程度的凋亡，但細胞死亡比例均低于K562細胞，說明AXIIR誘導(dǎo)人類細胞凋亡存在一定的普遍性，但也與特定細胞類型有關(guān)。
　　 在目前的文獻報道中，AXIIR均是作為AnnexinⅡ的細胞膜受體來介導(dǎo)AnnexinⅡ的信號傳遞，所以

5、我們需要了解AXIIR的誘導(dǎo)細胞凋亡功能是否由AnnexinⅡ信號引起。首先，我們通過免疫熒光染色方法定位AXIIR-myc分布在細胞漿中。另外，蛋白酶體抑制劑MG132處理并未增加AXIIR的蛋白水平，這也排除了胞漿內(nèi)的AXIIR在被溶酶體和泛素化降解的可能性。AnnexinⅡ在一個廣泛的濃度范圍內(nèi)并不能影響AXIIR誘導(dǎo)的細胞凋亡作用，說明AXIIR并不是作為AnnexinⅡ的受體來誘導(dǎo)凋亡的。
　　 為了了解AXIIR誘導(dǎo)

6、細胞凋亡的機制，我們檢測了凋亡通路相關(guān)蛋白的表達量和活性，主要包括幾種caspase和Bcq-2家族成員Bcq-2和BCL-XL。在AXIIR引起的細胞凋亡過程中，Caspase8,3均被激活。Caspase8抑制劑的使用也證實了Caspase8在AXIIR誘導(dǎo)細胞凋亡功能中發(fā)揮的重要作用。而隨后的免疫沉淀實驗表明AXIIR結(jié)合并激活pro-Caspase8，卻并不依賴于FADD。此外，下調(diào)FADD的表達并不會影響AXIIR激活Casp

7、ase8的能力。另外AXIIR截短體表達實驗說明Caspase8的羧基端對于Caspase8的激活是必需的，當(dāng)然氨基端也發(fā)揮了一定作用。再者，在死亡受體誘導(dǎo)形成的DISC中并未檢查到AXIIR的表達，說明AXIIR沒有參與死亡受體誘導(dǎo)的Caspase8激活。
　　 在我們的研究中，AXIIR不僅激活Caspase8，也同時激活了Caspase9和下調(diào)了BCL-2和BCL-XL的蛋白水平，而Bax水平無變化。BCL-XL高表達阻斷

8、線粒體途徑對AXIIR誘導(dǎo)的細胞凋亡沒有影響。這說明線粒體途徑在AXIIR誘導(dǎo)的細胞凋亡中并不是必需的，激活的Caspase8足以直接激活Caspase3引起凋亡。
　　 我們進一步分析了AXIIR在不同細胞類型中的表達水平，發(fā)現(xiàn)AXIIR的mRNA很容易被檢測到，而蛋白卻幾乎不能夠檢測到。提示我們：AXIIR從mRNA到蛋白的翻譯過程受到嚴格調(diào)控。研究進一步發(fā)現(xiàn)AXIIR翻譯抑制是受其5’UTR區(qū)的調(diào)控。雖然我們嘗試用幾種死亡

9、受體的配體、抗癌藥和紫外線照射的方法來找到可以使AXIIR的翻譯被激活的信號，但是并沒有獲得成功，這仍然需要進一步研究。
　　 綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)了AXIIR除了作為細胞表面受體介導(dǎo)信號以外，還分布在細胞漿中，并主要通過激活Caspase8來誘導(dǎo)細胞凋亡。我們的研究揭示了AXIIR的新功能和激活Caspase8的一種新的方式，為對凋亡發(fā)生的分子機制的研究提供了新的線索。
　　 二、Tmed2促進小鼠前成骨細胞增殖功能研究

10、 我們實驗室通過對隨機siRNA文庫的篩選得到了一些與小鼠MC3T3-El前成骨細胞增殖相關(guān)的基因。我們通過基因上調(diào)和下調(diào)的方法對Tmed2基因促進MC3T3-E1細胞增殖的功能進行了驗證。通過MTS、細胞周期分布檢測、相關(guān)周期蛋白表達水平檢測等方法證明該基因通過上調(diào)CyclinA的表達水平,增高MC3T3-E1細胞S期比例,從而促進MC3T3-E1細胞增殖加快。此外,MC3T3-E1細胞在雌激素作用下增殖加快,此時Tmed2表達水平增