oxLDL干擾HUVECs的DSG1和DSC2表達(dá)并增加單層內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)LDL的通透性.pdf

1、研究背景：關(guān)于動(dòng)脈粥樣硬化(AS)的發(fā)生,目前普遍認(rèn)為與血漿中脂蛋白水平的升高，血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷導(dǎo)致的動(dòng)脈壁通透性增加以及脂蛋白穿過內(nèi)皮屏障在內(nèi)皮下沉積等有關(guān)。在動(dòng)脈粥樣硬化（AS）斑塊和泡沫細(xì)胞中檢測(cè)到了氧化修飾的低密度脂蛋白（oxLDL），提示oxLDL與AS的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。但迄今為止未見oxLDL促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)LDL通透性機(jī)制方面的報(bào)道。橋粒芯糖蛋白-1(DSG1)和橋粒芯膠蛋白-2(DSC2)屬于橋粒鈣粘素蛋白家族成員，存

2、在于血管內(nèi)皮細(xì)胞間隙，發(fā)揮了血管壁與血液間的物理屏障作用，維持細(xì)胞與細(xì)胞之間的完整性。因此內(nèi)皮細(xì)胞與細(xì)胞間的這種橋粒連接在通透性調(diào)控方面起了重要的作用。本研究意在探討xLDL對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞DSG1和DSC2表達(dá)的影響，以及由此導(dǎo)致對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞通透性的影響。
　　實(shí)驗(yàn)一，oxLDL對(duì)HUVEC細(xì)胞DSG1，DSC2表達(dá)的影響
　　目的：觀察oxLDL對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞上跨膜蛋白DSG1和DSC2表達(dá)的影響，以及人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞受到這

3、種氧化型脂蛋白刺激后對(duì)單層細(xì)胞通透性的變化。
　　方法：每次實(shí)驗(yàn)前24小時(shí)，給HUVECs換新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)后加處理因素。不同濃度oxLDL（0 mg/L，10 mg/L，25 mg/L，50 mg/L）處理HUVEC24h，檢測(cè)細(xì)胞 DSG1，DSC2 mRNA和蛋白的表達(dá)，再用50mg/L oxLDL分別處理HUVEC不同時(shí)間（0h，6h，12h，24h），用Western blotting和RT-PCR分別檢測(cè)細(xì)胞DSG1，D

4、SC2 mRNA和蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：HUVECs上有DSG1、DSC2 mRNA與蛋白質(zhì)的表達(dá)；oxLDL使DSG1、DSC2 mRNA與蛋白的表達(dá)下調(diào)，且成時(shí)間與劑量依賴關(guān)系（P<0.05）。
　　實(shí)驗(yàn)二，oxLDL對(duì)HUVECs單層通透性的影響
　　目的：觀察oxLDL對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞單層通透性的影響。
　　方法：用不同濃度的oxLDL（0 mg/L，10 mg/L，25 mg/L，50 mg/L）分

5、別或者與SOD共同孵育HUVECs24h，空白組作為對(duì)照，通過Transwell系統(tǒng)檢測(cè)單層細(xì)胞對(duì)BSA和LDL的通透性情況，采用熒光分光光度法測(cè)定FITC-BSA和FITC-LDL的含量。
　　結(jié)果：oxLDL能顯著增加HUVECs單層對(duì)BSA和LDL的通透性，且作用隨著濃度增加而增強(qiáng)，在50mg/L時(shí)有顯著作用（P<0.05）；SOD能使50mg/L oxLDL誘導(dǎo)的HUVECs單層通透性降低（P<0.05）。
　　實(shí)驗(yàn)

6、三，ROS參與oxLDL對(duì)HUVEC DSG1和DSC2表達(dá)的調(diào)節(jié)
　　目的：探討oxLDL是否通過促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)ROS生成參與調(diào)節(jié)HUVEC細(xì)胞DSG1和DSC2的表達(dá)。
　　方法：用 LDL(50mg/L)、oxLDL(50mg/L)、BSA(100mg/L)、H2O2(5mg/L)分別與HUVECs孵育24h，空白組作為對(duì)照，用RT-PCR與Western blotting分別檢測(cè) HUVECs DSG1、DSC2 mRN

7、A與蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。用50mg/L的oxLDL、50mg/LSOD預(yù)處理再加oxLDL、50mg/LSOD分別與 HUVECs孵育24h，用DCFH-DA染色法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧的生成情況；用RT-PCR與Western blotting分別檢測(cè)HUVECs DSG1、DSC2 mRNA與蛋白質(zhì)的表達(dá)水平；用激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞DSG1的免疫反應(yīng)性。
　　結(jié)果：oxLDL、H2O2使 HUVECs DSG1、DSC2 mRNA