CHFR,CDKN2A甲基化在食管鱗癌中的表達及其在放射抵抗中的作用研究.pdf

1、目的：
　　(1)通過研究食管鱗癌KYSE150，KYSE180細胞系輻照前后CHFR及CDKN2A基因DNA甲基化程度變化及mRNA的表達變化，研究抑癌基因的甲基化及其基因表達能力的改變是否參與到食管鱗癌的放射抵抗。
　　(2)通過研究28例食管鱗癌組織、癌旁組織及正常食管組織CHFR及CDKN2A基因DNA甲基化與臨床病理關(guān)系，研究CHFR及CDKN2A基因DNA甲基化在食管鱗癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用及意義。
　　

2、方法：
　　研究一、放射抵抗細胞系中CHFR及CDKN2A基因DNA甲基化表達情況
　　1.細胞復蘇、傳代及輻照
　　選擇KYSE150，KYSE180細胞系，在適量RPMI1640細胞液中輕輕吹打至散開后移入培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于37℃，5％二氧化碳的細胞培養(yǎng)箱進行細胞培養(yǎng)、擴增，隨后進行傳代。將在對數(shù)生長期生長的KYSE150，KYSE180細胞制作為細胞懸液，800rpm，10min中離心，棄去上清，使用1640培養(yǎng)基重

3、懸細胞，調(diào)整細胞濃度，將細胞分別接種在六孔板中，每孔1*105個細胞，待細胞貼壁、密度在70％左右且狀態(tài)良好時，分別給予8Gy的高能量X射線（放射源距離標本100cm，照射野大小為20cm×20cm，吸收劑量率為1.50Gy/min。）照射后，37℃、5％二氧化碳培養(yǎng)，并及時更換培養(yǎng)液;細胞照射后第5天，以上述劑量再次處理細胞，并及時更換培養(yǎng)液，直至細胞凋亡、壞死后形成細胞克隆。將輻照耐受的細胞系稱為KYSE150-8Gy，KYSE18

4、0-8Gy細胞系。
　　2.DNA的提取、甲基化處理及焦磷酸測序
　　收集處于對數(shù)生長期的細胞(KYSE150，KYSE180，KYSE150-8Gy，KYSE180-8Gy)，2*106/管，加入DNA提取液200μl，并加入10mg/ml的蛋白酶K至終濃度100μg/ml，使細胞完全裂解，之后56度，水浴2小時，向消化后的DNA樣品中加入250ul酚氯仿，蓋上管蓋，顛倒混勻。經(jīng)樣本離心，再次氯仿抽提，吸取上清后無水乙醇處

5、理等步驟，最后向沉淀中加入100μl TE溶液，室溫溶解15分鐘，期間輕輕振蕩混勻，完成細胞系樣本中DNA的提取，提取后的DNA用重亞硫酸鹽處理完成甲基化。采用PyroMark Assay design2.0針對CDKN2A和CHFR基因啟動子CpG島設計PCR引物和測序引物，按PyroMark PCR Kit試劑盒（德國，Qiagen）說明書要求完成焦磷酸測序前的PCR擴增反應。
　　3.樣本總mRNA提取及RT-PCR

6、　　收集處于對數(shù)生長期的細胞(KYSE150，KYSE180，KYSE150-8Gy，KYSE180-8Gy)，2*106/管，每管加入1.0ml Trizol溶液，裂解細胞后加入氯仿處理，經(jīng)離心吸取上清加入異丙醇，冰上放置十分鐘后離心，吸去管中液體，75％乙醇處理后溶解RNA，完成RNA提取。取0.5ml EP管，將RNA與引物的混合物，將5×buffer，DTT，逆轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV)等反應品順序加入進行RT反應，得到cDNA，之后

7、進行實時熒光定量PCR擴增，數(shù)據(jù)統(tǒng)計、結(jié)果分析等。
　　4.放射抵抗細胞系與原始細胞系細胞增殖實驗
　　KYSE150、KYSE150-8G、KYSE180及KYSE180-8G細胞起始接種濃度為1*105/瓶，分別于1，3，5，7天消化后計數(shù)，配對比較細胞系增殖能力。
　　研究二、食管鱗癌、癌旁及正常食管組織中CHFR，CDKN2A基因異常甲基化研究
　　1.標本來源
　　28例標本來選自2014.5.～

8、2015.4.期間安徽省立醫(yī)院胸外科手術(shù)切除的原發(fā)性食管鱗癌病例，其中男性25例，女性3例;病理分期Ⅰ期病例8例，Ⅱ期病例15例，Ⅲ期病例5例。實驗使用的組織樣本為腫瘤組織，腫瘤旁組織及距離腫瘤至少5cm以遠的食管正常組織。本組病例手術(shù)前未行放療、化療，病理資料完整，術(shù)后長期隨訪，資料完備，上述病例來源的患者均已知情同意。
　　2.DNA的提取、甲基化處理及焦磷酸測序
　　在液氮中研磨組織標本(100mg)，加入DNA提取液

9、200μ l，繼續(xù)研磨至勻漿，并加入10mg/ml的蛋白酶K至終濃度100μ g/ml，之后56度，水浴2小時，向消化后的DNA樣品中加入250ul酚氯仿，蓋上管蓋，顛倒混勻。經(jīng)樣本離心，再次氯仿抽提，吸取上清后無水乙醇處理等步驟，最后向沉淀中加入100μl TE溶液，室溫溶解15分鐘，期間輕輕振蕩混勻，完成細胞系樣本中DNA的提取，提取后的DNA用重亞硫酸鹽處理完成甲基化。采用PyroMark Assay design2.0針對CDK

10、N2A和CHFR基因啟動子CpG島設計PCR引物和測序引物，按PyroMark PCRKit試劑盒（德國，Qiagen）說明書要求完成焦磷酸測序前的PCR擴增反應。
　　3.樣本mRNA提取及RT-PCR
　　在液氮中研磨組織標本(100mg)，加入1.0ml Trizol溶液，磨成勻漿，加入1.0ml Trizol溶液，加入氯仿處理，經(jīng)離心吸取上清加入異丙醇，冰上放置十分鐘后離心，吸去管中液體，75％乙醇處理后溶解RNA，

11、完成RNA提取。取0.5mlEP管將RNA與引物的混合物，將5×buffer，DTT，逆轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV)等反應品順序加入進行RT反應，最后進行反應及分析結(jié)果。
　　結(jié)果：
　　研究一、
　　1.KYSE150，KYSE180及KYSE150-8Gy，KYSE180-8Gy細胞系的DNA甲基化特異性檢測均發(fā)現(xiàn)CHFR及CDKN2A基因DNA甲基化現(xiàn)象;
　　2.放射抵抗的KYSE150-8Gy，KYSE180-

12、8Gy細胞系中CHFR及CDKN2A基因DNA甲基化程度高于KYSE150，KYSE180細胞系;
　　3.而KYSE150-8Gy，KYSE180-8Gy細胞系CHFR及CDKN2A基因mRNA表達顯著低于KYSE150，KYSE180細胞系。
　　4.KYSE150-8Gy，KYSE180-8Gy細胞系增殖能力顯著高于KYSE150，KYSE180細胞系，p＜0.05。
　　研究二、
　　1.28例患者完成了

13、本研究，樣本為癌組織、癌旁組織及正常食管組織成對樣本。CHFR基因DNA甲基化發(fā)生率分別為46.32％、42.05％和22.33％; CDKN2A基因DNA甲基化發(fā)生率分別為27.51％、24.54％和10.89％。正常食管組織內(nèi)CHFR及CDKN2A基因甲基化發(fā)生率顯著低于癌組織及癌旁組織，但CHFR及CDKN2A基因甲基化與腫瘤分期無關(guān)。
　　2.CHFR及CDKN2A基因mRNA在不同組織中的差異:
　　CHFR和CD

14、KN2A基因mRNA表達在癌組織及癌旁組織中顯著低于正常組織(p＜0.001)，CDKN2A基因mRNA表達在癌組織中也低于癌旁組織，差別具有統(tǒng)計學意義(p=0.026)
　　3.CHFR及CDKN2A基因mRNA在癌組織、癌旁組織及正常食管組織表達差異與臨床分期無關(guān)。
　　4.mRNA在癌組織、癌旁及正常食管組織表達差異與腫瘤分化程度關(guān)系:
　　CHFR基因mRNA在癌組織中表達差異與分化程度無關(guān)，在癌旁組織中中分化

15、癌與低分化癌表達程度具有統(tǒng)計學意義(p=0.034);在正常組織中表達差異與分化程度無關(guān)。
　　CDKN2A基因mRNA在癌組織中表達差異與分化程度無關(guān)，在癌旁組織中表達差異與分化程度無關(guān);在正常組織中表達中分化癌與低分化癌表達差異具有統(tǒng)計學意義(p=0.023)。
　　結(jié)論：
　　研究一
　　1.食管鱗癌CHFR及CDKN2A基因甲基化在KYSE-150、KYSE-180食管鱗癌細胞系是一種高發(fā)現(xiàn)象。
　

16、　2.大劑量輻照后，形成放射線耐受細胞系，KYSE-150-8Gy、KYSE-180-8Gy細胞中CHFR、CDKN2A基因甲基化程度高于原始細胞系，與此相對應的CHFR、CDKN2A基因mRNA表達顯著低于原始細胞系，說明CHFR、CDKN2A基因高甲基化導致的腫瘤抑制功能的喪失，使癌腫細胞DNA修復能力和抗凋亡能力顯著加強，并因此抗拒了放射線的滅活。
　　3.放射抵抗細胞系KYSE150-8Gy，KYSE180-8Gy腫瘤增殖

17、能力增強，具有更為惡性的生物學行為。
　　研究二
　　1.食管鱗癌癌組織、癌旁組織及正常組織中存在CHFR及CDKN2A基因甲基化現(xiàn)象，說明該基因甲基化是食管鱗癌發(fā)生發(fā)展中的一種表觀遺傳事件。
　　2.正常組織甲基化比率顯著低于癌組織及癌旁組織，且與mRNA表達一致，說明CHFR及CDKN2A基因甲基化導致的失活可能也參與到食管鱗癌的發(fā)生階段。
　　3.ESCC癌組織及癌旁組織中CHFR及CDKN2A甲基化比率顯

18、著高于正常組織，mRNA表達顯著低于正常組織，但DNA甲基化程度與腫瘤分期無關(guān)，說明在腫瘤的進程中作為抑癌基因的CHFR及CDKN2A基因甲基化并由此導致的表達缺失貫穿于食管鱗癌的整個發(fā)展過程。
　　4.CHFR及CDKN2A基因甲基化與腫瘤的分期無關(guān)，與腫瘤的分化程度部分相關(guān)（CHFR的mRNA在中分化與低分化患者癌旁組織的表達有差異，CDKN2A的mRNA在中分化與低分化患者正常組織中表達有差異），說明CHFR及CDKN2A基