LHX6基因的甲基化檢測及其在腫瘤細胞中的表達研究.pdf

1、惡性腫瘤危害全人類的健康，治療和預防腫瘤是全球性的課題。腫瘤是一種基因型疾病，近年來，表觀遺傳(epigeneties)突變的研究越來越受到重視，其中DNA甲基化突變是最常見的突變方式。研究表明，CpG島超甲基化異常往往早于細胞惡性增生，腫瘤組織中常發(fā)現(xiàn)有全基因組低甲基化而局部高甲基化的現(xiàn)象?；虻募谆桓淖兓虻木幋a序列，且該現(xiàn)象可為去甲基化藥物逆轉。因此，對腫瘤甲基化標記基因的檢測可用于腫瘤診斷和預后評估，其甲基化位點有潛力成為治

2、療的分子靶點。所以，尋找腫瘤中的甲基化相關標記性基因成為診療新方法發(fā)展的關鍵，是目前癌癥研究的熱點之一。 LHX6基因位于人染色體上9q33.2位置，全稱是Homo sapiens LIM homeobox 6。其產(chǎn)物屬于LIM蛋白家族，可結合DNA和蛋白質，作為轉錄因子存在，在胚胎發(fā)育中起重要作用，與牙齒發(fā)育和神經(jīng)細胞遷徙、定位和分型有關。新近研究表明LHX6很可能是一個頭頸癌相關基因。但關于LHX6基因與其他腫瘤的相關性，以

3、及在腫瘤中的作用仍知之甚少。因此，本文希望在A549肺癌細胞株、HepG2肝癌細胞株、MCF-7乳腺癌細胞株及Hela宮頸癌細胞株四種腫瘤細胞中分析LHX6基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)，探討LHX6基因在腫瘤增殖中的作用，為該基因作為診斷靶基因和去甲基化治療靶點提供基礎理論依據(jù)。 本文首先對LHX6全基因序列中的CpG島進行分析，并結合基因啟動子區(qū)分析對基因啟動轉錄可能產(chǎn)生影響的甲基化位點。MS-PCR分析該段區(qū)域在A549肺癌細胞株

4、、HepG2肝癌細胞株、MCF-7乳腺癌細胞株及Hela宮頸癌細胞株四種腫瘤細胞中的甲基化狀態(tài)。用5-Aza-CdR對四種腫瘤細胞進行去甲基化處理。由于5-Aza-CdR的去甲基化作用存劑量依賴性，所以首先尋找有效處理濃度。對藥物處理前后的腫瘤細胞進行顯微鏡觀察形態(tài)變化和MTT法檢測細胞增殖率的改變。繼而用RT-PCR檢測藥物處理前后四種腫瘤細胞中LHX6基因表達的改變；MS-PCR檢測藥物處理前后LHX6基因在腫瘤細胞中的甲基化水平。

5、 結果顯示LHX6基因啟動子區(qū)附近存在CpG島，該段區(qū)域甲基化狀態(tài)的改變可能會影響基因的表達。MS-PCR發(fā)現(xiàn)LHX6基因在四種腫瘤細胞中存在不同程度的甲基化，其中A549細胞中存在較其他二種腫瘤細胞高的甲基化狀態(tài)(甲基化特異PCR條帶光密度值占甲基化和非甲基化條帶廣密度總值的71.4％，而其他三種腫瘤細胞中只占55％左右)。在5-Aza-CdR處理濃度梯度實驗中尋找到終濃度為1×10-6mol/L的5-Aza-CdR，可使細胞

6、增殖率最大程度降低，有效抑制腫瘤細胞生長。MTT法檢測到藥物處理組A549細胞增殖率相對于對照組OD值降低72.2％。顯微鏡觀察藥物處理組和對照組的腫瘤細胞，發(fā)現(xiàn)四種腫瘤細胞的形態(tài)均有改變，其中對A549腫瘤細胞的影響最明顯，細胞形態(tài)明顯不規(guī)則，可觀察到部分細胞破碎、死亡．RT-PCR反應發(fā)現(xiàn)5-Aza-CdR處理后，LHX6基因在A549細胞中恢復表達，而其他三種腫瘤細胞的對照組和藥物處理組中均無表達。該現(xiàn)象與MTT法檢測到的A549