組蛋白甲基化修飾在HBV誘導(dǎo)肝細(xì)胞基因表達(dá)改變中的作用機制研究.pdf

1、研究背景與目的:
　　乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染可以導(dǎo)致急/慢性肝炎、肝硬化及肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的發(fā)生,這些疾病都嚴(yán)重威脅著全人類的健康。全世界范圍內(nèi)大約有3.5億人為慢性乙型肝炎患者,我國HBV感染者也接近1.2億。HBV感染的免疫學(xué)機制研究一直以來受到研究者的密切關(guān)注,近些年,HBV相關(guān)的表觀遺傳學(xué)致病機制的研究也逐漸成為研究的熱點。為了支持

2、自身的復(fù)制和存活, HBV感染宿主細(xì)胞后改變了宿主基因的表達(dá),而且促進(jìn)了肝細(xì)胞的損傷。但是,這種潛在的作用機制仍然沒有完全被了解釋清楚。有研究提示組蛋白 H3的第4位賴氨酸三甲基化(trimethylated histone H3 lysine4,H3K4me3)修飾與基因活化相關(guān),而組蛋白H3的第27位賴氨酸三甲基化(trimethylated histone H3 lysine27,H3K27me3)修飾與基因沉默相關(guān)。因此,我們將

3、從表觀遺傳學(xué)的角度出發(fā),以HepG2.2.15和HepG2細(xì)胞為細(xì)胞模型,通過染色質(zhì)免疫共沉淀-高通量測序(chromatin immunoprecipitation-sequencing,ChIP-Seq)方法,研究H3K4me3和H3K27me3修飾在HBV誘導(dǎo)相關(guān)致病基因表達(dá)改變中的作用機制,對 HBV誘導(dǎo)肝細(xì)胞表觀遺傳學(xué)改變后導(dǎo)致疾病發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)機制進(jìn)行闡述,為乙型肝炎新的治療策略提供理論依據(jù)。
　　實驗方法:

4、　　按相應(yīng)的要求培養(yǎng)HepG2.2.15和HepG2細(xì)胞,通過RNA-測序(RNA-sequencing, RNA-Seq)和 ChIP-Seq技術(shù)分別獲得兩種細(xì)胞的數(shù)字基因表達(dá)譜( digital gene expression profiling,DGE)及相應(yīng)的組蛋白甲基化修飾譜。通過生物信息學(xué)的分析可獲得 HBV相關(guān)的差異基因表達(dá)譜。依據(jù)文獻(xiàn)提供的基因功能,挑選特異性的疾病相關(guān)差異表達(dá)基因按基因的功能進(jìn)行分類分析。分別收集相應(yīng)的

5、臨床肝活檢組織,包括未治療的慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)病人31例,已經(jīng)用替比夫定治療(600mg每天,口服)兩年的8例,HBV病毒陰性的7例(作為健康人對照(health control, HC))。按相應(yīng)的要求培養(yǎng) HepG2.2.15、HepG2及 HepG2.2.15-T(經(jīng)替比夫定處理)細(xì)胞作為實驗的細(xì)胞模型。通過實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time polyme

6、rase chain reaction, QPCR)技術(shù)分別檢測細(xì)胞和肝組織中 HBV共價閉合環(huán)狀 DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)的表達(dá)水平。利用QPCR及染色質(zhì)免疫共沉淀-實時定量聚合酶鏈反應(yīng)( chromatin immunoprecipitation- quantitative real time polymerase chain reaction,ChIP-QPCR)技術(shù)分別

7、從細(xì)胞水平和組織水平,對HBV相關(guān)疾病基因的表達(dá)情況和組蛋白甲基化修飾情況進(jìn)行檢測驗證。對檢測的數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性統(tǒng)計分析。利用GraphPad Prism software4.0軟件對相關(guān)的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析,通過雙側(cè)T檢驗分析兩種細(xì)胞中的信使RNA(message RNA,mRNA)的表達(dá)差異和組蛋白甲基化差異,當(dāng)P值≤0.05認(rèn)為有差異有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義。
　　實驗結(jié)果:
　　(1)首先我們通過RNA-測序技術(shù)分別獲得Hep

8、G2.2.15和HepG2兩種細(xì)胞的數(shù)字基因表達(dá)譜。發(fā)現(xiàn) HBV可以引起宿主細(xì)胞大量基因表達(dá)的改變,這些基因中一些表現(xiàn)為表達(dá)上調(diào),另外一些表現(xiàn)為表達(dá)下調(diào)。
　　(2)我們通過ChIP-Seq技術(shù)分別獲得HepG2.2.15和HepG2兩種細(xì)胞的組蛋白甲基化修飾譜。發(fā)現(xiàn) HBV可以引起宿主細(xì)胞大量基因座的組蛋白甲基化修飾改變,而且HBV誘導(dǎo)的組蛋白甲基化修飾改變與宿主基因表達(dá)改變之間有密切的相關(guān)性。
　　(3)通過對 HepG

9、2.2.15和 HepG2兩種細(xì)胞的數(shù)字基因表達(dá)譜進(jìn)一步分析獲得了HBV相關(guān)的差異基因表達(dá)譜,這些差異表達(dá)基因(differentially expressed gene,DEG)中許多與HBV相關(guān)疾病有著密切的關(guān)系。提示了HBV改變宿主基因表達(dá)的改變在它的致病中起到了作用。
　　(4)我們選取代表性的差異表達(dá)基因,按基因的功能進(jìn)行了分類分析。發(fā)現(xiàn)這些差異表達(dá)基因中許多基因與 HBV進(jìn)入宿主細(xì)胞、宿主細(xì)胞的炎癥、肝臟纖維化和成瘤性

10、都有著密切的關(guān)系,提示 HBV可能通過改變相關(guān)致病基因的表達(dá)而導(dǎo)致疾病的發(fā)生。我們的研究中還發(fā)現(xiàn),用抗HBV藥物替比夫定處理HepG2.2.15細(xì)胞后可以將H3K4me3的修飾水平充分地修復(fù)到HepG2未經(jīng)HBV轉(zhuǎn)導(dǎo)時的修飾水平。同樣的,我們在臨床肝活檢組織(健康人對照和慢性乙型肝炎患者)中也得到了相同的結(jié)果,替比夫定在顯著抑制 HBV復(fù)制的同時,很大程度上修復(fù)了這些重要基因的組蛋白甲基化修飾,尤其是H3K4me3的修飾水平。提示替比夫

11、定對HBV感染患者的治療作用可能是通過表觀遺傳學(xué)機制來實現(xiàn)的。
　　(5)在研究中我們還發(fā)現(xiàn),HepG2細(xì)胞無論在有沒有HBV存在的情況下,特異性組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶SMYD3和EZH2的表達(dá)水平并沒有明顯的差異。提示HBV誘導(dǎo)宿主基因的組蛋白甲基化修飾水平的改變并不是通過調(diào)節(jié)組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)來實現(xiàn)的。
　　結(jié)論:
　　從我們的研究數(shù)據(jù)中可以發(fā)現(xiàn) HBV可以引起宿主細(xì)胞大量基因座的組蛋白甲基化修飾的改變,而且這些

12、基因的表達(dá)水平也發(fā)生了相應(yīng)的改變,在這些基因基中有許多基因與 HBV進(jìn)入宿主細(xì)胞、宿主細(xì)胞的炎癥、肝臟纖維化和成瘤性都有著密切的關(guān)系。有趣的是,在我們的研究中發(fā)現(xiàn)用抗HBV藥物替比夫定處理HepG2.2.15細(xì)胞后,可以將H3K4me3的修飾水平充分地修復(fù)到HepG2未經(jīng)HBV轉(zhuǎn)導(dǎo)時的修飾水平。更重要的是,我們在臨床肝活檢組織(健康人對照和慢性乙型肝炎)中也發(fā)現(xiàn),替比夫定不僅糾正了 HBV相關(guān)靶基因的表達(dá),而且在很大程度上修復(fù)了這些重要

13、基因的H3K4me3修飾水平。另外,HepG2細(xì)胞無論在有沒有HBV存在的情況下,特異性組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶SMYD3和EZH2的表達(dá)水平并沒有明顯的差異。因此,我們的研究數(shù)據(jù)表明,HBV感染肝細(xì)胞后可以誘導(dǎo)宿主細(xì)胞發(fā)生異常的組蛋白修飾改變,隨之疾病相關(guān)基因的表達(dá)水平也發(fā)生了改變,這些改變可能很大程度上參與了 HBV誘導(dǎo)肝癌的形成,而且替比夫定在很大程度上可以使這些改變得到逆轉(zhuǎn)。因此,從表觀遺傳學(xué)角度可以說明,替比夫定的治療可能對 HBV