白細(xì)胞介素6及下游JAK-STAT3信號通路在前列腺相關(guān)疾病中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、【研究背景】
　　白細(xì)胞介素6（IL-6）是一種多功能細(xì)胞因子。研究發(fā)現(xiàn)：IL-6可能參與慢性前列腺炎的病理過程；同時(shí)在前列腺癌激素非依賴性形成以及神經(jīng)內(nèi)分泌化過程中，IL-6仍可能發(fā)揮著重要作用。然而在這兩類疾病中，IL-6的具體作用機(jī)制仍不清楚。目前為止，仍缺乏在慢性前列腺炎中關(guān)于IL-6的分子流行病學(xué)研究；同時(shí)對于IL-6及其下游信號在前列腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用及機(jī)制，仍需深入探索。
　　【目的】
　　1.針對

2、Ⅲ型慢性前列腺炎，在蛋白質(zhì)表達(dá)及基因多態(tài)性層面上，對IL-6進(jìn)行分子流行病學(xué)調(diào)查；2.研究IL-6及下游JAK/STAT3信號途徑對前列腺癌細(xì)胞系生物學(xué)行為的影響；3.在前列腺癌細(xì)胞系中，建立靶向沉默JAK/STAT3信號途徑的RNA干涉體系；4.分析JAK/STAT3信號途徑靶向沉默后，前列腺癌細(xì)胞系生物學(xué)行為的改變及可能機(jī)制。
　　【方法】
　　1.采用流行病學(xué)調(diào)查方法，選定IL-6分子流行病學(xué)研究的基線人群，結(jié)合環(huán)境因

3、子及癥狀差異進(jìn)一步建立分組研究隊(duì)列；2.以初次的NIH-CPSI（NationalInstitutesofHealthchronicprostatitissymptomindex，美國國立衛(wèi)生研究院慢性前列腺炎癥狀評分）問卷調(diào)查及二次臨床篩查為病例納入方式，篩選Ⅲ型慢性前列腺炎患者并按亞型進(jìn)一步分組，系統(tǒng)分析IL-6與癥狀、其他炎癥因子及氧化應(yīng)激水平的關(guān)系；3.酶聯(lián)免疫吸附法測定血清及EPS（Expressedprostaticsecr

4、etion，前列腺液）中IL-6等細(xì)胞因子水平，并分析炎癥因子的相互關(guān)系；4.利用DCFH2-DA（2',7'-二氯二氫熒光素二乙酯，2′,7′-dichlorofluorescindiacetate）測定EPS中ROS（reactiveoxygenspecies，活性氧）水平增長率，并分析ROS與IL-6水平的關(guān)系；5.采用ABTS（2,2'-Azinobis3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonicAcidA

5、mmoniumSalt，2,2'-聯(lián)氮雙3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸二銨鹽）比色法測定EPS中TAOC（Totalantioxidantcapacity，總抗氧化能力）相對水平，并分析TAOC與IL-6水平的關(guān)系；6.四聚體ARMS-PCR（Amplificationrefractorymutationsystempolymerasechainreaction，擴(kuò)增受阻突變體系聚合酶鏈反應(yīng)）檢測IL-6分子啟動子區(qū)-174G/C基因型，

6、并分析與EPS中IL-6水平與癥狀的關(guān)系；7.分子生物學(xué)方法構(gòu)建PSMA（Prostatespecificmembraneantigen，前列腺特異性膜抗原）特異性單鏈抗體融合蛋白并鑒定其活性；8.利用分子生物學(xué)軟件，設(shè)計(jì)STAT3（Signaltransducerandactivator3，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和激活因子3）特異性siRNA（SmallinterferingRNA，小干擾RNA），并通過流式細(xì)胞儀分析及細(xì)胞ELISA（Enzyme

7、linkedimmunosorbentassay，酶聯(lián)免疫吸附法）方法鑒定PSMA單鏈抗體融合蛋白對其的靶向遞送能力；9.利用IL-6對前列腺癌LNCaP細(xì)胞系的雙重生物學(xué)作用，建立IL-6處理的前列腺癌細(xì)胞系研究模型；10.利用STAT3的特異性siRNA處理LNCaP細(xì)胞，WesternBlot方法檢測相關(guān)STAT3分子的表達(dá)；11.利用MTT[3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-dipheny

8、tetrazoliumromide，噻唑藍(lán)]方法描繪細(xì)胞進(jìn)行生長曲線；12.采用PI（Propidiumiodide，碘化丙啶）染色流式細(xì)胞術(shù)檢測處理細(xì)胞的周期的變化，用AnnexinV（膜聯(lián)蛋白-V）/PI雙染色流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡。
　　【結(jié)果】
　　1.III型慢性前列腺炎IL-6分子流行病學(xué)研究
　　1)各亞型CP/CPPS患者EPS中IL-6水平，較對照組均明顯增高，但不伴有血清IL-6的變化。
　　2)

9、在IIIa亞型癥狀加重的病理過程中，IL-6與TNF-α、IL-2、IL-8、IL-10共同參與其病理進(jìn)程，并伴有氧化應(yīng)激水平的增高及抗氧化能力的下降。
　　3)IL-6參與IIIb亞型的病理進(jìn)程，在IIIb亞型癥狀加重的過程中未發(fā)現(xiàn)TNF-α、IL-2、IL-8、IL-10及氧化應(yīng)激水平的明顯變化。
　　4)盡管對于CP/CPPS鏡檢分型標(biāo)準(zhǔn)的意義存在爭議，但依據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)的研究發(fā)現(xiàn)，IL-6在兩型CP/CPPS中參與的病理機(jī)

10、制可能不同。
　　5)IL-6啟動子-174C/G基因型的CP/CPPS患者伴有較高水平的EPS-IL-6，同時(shí)其癥狀分值明顯高于GG、CC純合子患者。
　　2.外源性IL-6對前列腺癌細(xì)胞系生物學(xué)行為的影響及其下游信號傳導(dǎo)研究
　　1)在外源性IL-6處理LNCaP細(xì)胞的初期，IL-6具有明顯的促細(xì)胞凋亡，阻滯細(xì)胞周期及抑制增殖的作用。
　　2)在IL-6抑制LNCaP細(xì)胞增殖階段，同時(shí)也導(dǎo)致LNCaP細(xì)胞分泌

11、PSA水平的增高。
　　3)在IL-6誘導(dǎo)PSA的信號傳導(dǎo)途徑中，STAT3發(fā)揮了重要作用，因?yàn)镾TAT3被靶向沉默后，隨著磷酸化STAT3的減少，PSA的分泌水平出現(xiàn)明顯降低。
　　4)STAT3并沒有參與IL-6對LNCaP細(xì)胞增殖的抑制過程，因?yàn)樵赟TAT3沉默后沒有觀察到IL-6處理LNCaP細(xì)胞生長曲線的變化，這表明：IL-6對LNCaP細(xì)胞的增殖抑制是通過其他信號傳導(dǎo)途徑來完成。
　　【結(jié)論】
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