柑橘衰退病毒的血清學(xué)特性分析及其誘導(dǎo)寄主差異表達(dá)基因的篩選.pdf

1、柑橘在世界果品產(chǎn)業(yè)中占有重要的經(jīng)濟(jì)地位。由柑橘衰退病毒(CTV)引起的衰退病是影響全球柑橘生產(chǎn)的重要病害之一。目前，許多國(guó)家防治該病毒采取的措施是種植無病毒苗木和利用弱毒株系的交叉保護(hù)作用及對(duì)調(diào)運(yùn)種苗實(shí)施檢疫。這些環(huán)節(jié)均需對(duì)病毒進(jìn)行檢測(cè)，血清學(xué)方法以其靈敏度高、快速、經(jīng)濟(jì)及適合大規(guī)模樣品檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于果樹病毒的檢測(cè)中。已有研究表明，CTV具有明顯的株系分化，株系間存在致病性的差異，但有關(guān)該病毒與寄主互作特性的研究尚很缺乏。

2、 本研究通過改進(jìn) CTV的提純方法，制備針對(duì)我國(guó)發(fā)生 CTV的多克隆和單克隆抗體，并對(duì)其檢測(cè)效果進(jìn)行分析；以柑橘離體培養(yǎng)植株為研究體系，分析了CTV對(duì)離體培養(yǎng)柑橘的形態(tài)建成和生長(zhǎng)發(fā)育及基因表達(dá)的影響，旨在為建立高通量、快速的病毒檢測(cè)技術(shù)提供有效的檢測(cè)試劑，為進(jìn)一步深入研究我國(guó)CTV的株系特點(diǎn)、篩選具有我國(guó)區(qū)域特點(diǎn)的 CTV 弱毒株系和探究該病毒與寄主互作關(guān)系并篩選有效的抗病毒基因等奠定基礎(chǔ)。取得的主要研究結(jié)果如下： 1.以田

3、間表現(xiàn)莖陷點(diǎn)癥狀的甜橙L5和S4為材料，利用改進(jìn)的提純方法獲得了 CTV的提純液，其產(chǎn)量為1 mg/100 g植物組織。用CTV免疫大耳白兔，獲得多克隆抗體，間接ELISA效價(jià)為1：25 600。用CTV免疫BALB/c小鼠，經(jīng)細(xì)胞融合、ELISA篩選和克隆化培養(yǎng)，獲得 18株能穩(wěn)定分泌抗CTV 單克隆抗體的雜交瘤單細(xì)胞株，腹水抗體的間接ELISA效價(jià)為1:12 800～1：204 800。對(duì)其中任意4株單克隆抗體進(jìn)行分析的結(jié)果表明，這

4、些抗體的抗原識(shí)別位點(diǎn)存在差異，其中 2G和3H的抗體類型及亞類為IgG2a，1E和4H為IgG2b。用所制備抗體對(duì)不同來源柑橘樣品的 CTV 檢測(cè)結(jié)果顯示，單克隆和多克隆抗體結(jié)合使用，采用三抗體夾心ELISA (TAS-ELISA)法可以獲得理想的檢測(cè)效果，其特異性強(qiáng)、靈敏度高。同時(shí)發(fā)現(xiàn)所分析4株單克隆抗體對(duì)不同的CTV分離物鑒別能力存在差異，但有關(guān)這些CTV分離物的特性及其血清學(xué)關(guān)系還需進(jìn)一步研究。 2.利用3種不同來源的CT

5、V抗體(PAb-I、PAb-L5和MAbs-S4)對(duì)田間柑橘樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，篩選到一個(gè)表現(xiàn)特異血清學(xué)性狀的分離物HB1，此分離物僅能被PAb-L5所識(shí)別，而與PAb-I和MAbs-S4均不發(fā)生免疫反應(yīng)。為了明確該分離物的血清學(xué)特性與其生物學(xué)性狀的關(guān)系并進(jìn)一步揭示血清學(xué)差異的分子機(jī)制，對(duì)CTV-HB1、CTV-L5和CTV-S4的生物學(xué)性狀進(jìn)行了觀察，并對(duì)其CP基因的RFLP組群和序列進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，3個(gè)CTV分離物均在墨兩哥來檬和

6、甜橙上產(chǎn)生典型的莖陷點(diǎn)癥狀；CTV-HB1的CP基因表現(xiàn)出單一的CP/HinfI RFLP譜型，同CTV-L5的CP/Hinf I RFLP譜型一致，但與CTV-S4的CP/Hinf I RFLP譜型存在較大差別。序列分析結(jié)果表明，CTV-HB1 CP基因的氨基酸序列CTV-L5、SY568和NUagA的氨基酸序列相似性均在97％以上。此外，CTV-HB1與CTV-L5 CP基因的氨基酸序列間僅有3個(gè)位點(diǎn)[84(S→L)、98(G→D)

7、和190(G→C)]的變異，而此3個(gè)氨基酸位點(diǎn)在其它已報(bào)道的CTV分離物中都是保守的。利用蛋白質(zhì)分析軟件對(duì)4個(gè)CTV分離物(HB1、L5、S4和0002)CP基因的抗原指標(biāo)及可能的抗原表位進(jìn)行推測(cè)的結(jié)果表明，CTV-HB1 僅在84和190氨基酸位點(diǎn)處有小的吸收峰，而在CTV-HB1和CTV-L5 CP基因的5′末端存在一相似的吸收峰，因此推測(cè)5′末端結(jié)構(gòu)的差異可能是造成CTV-HB1不能被PAb-I和MAbs-S4識(shí)別的直接原因。以上

8、結(jié)果暗示了CTV分離物的不同血清學(xué)特性，可以為揭示CP基因上的不同抗原決定簇及尋找新的株系特異性結(jié)合位點(diǎn)等提供新的依據(jù)。 3.建立了幼年態(tài)墨西哥來檬、甜橙和香櫞(C.medica)，及成年態(tài)魚橙的離體快繁體系，并篩選出成年態(tài)GL橙、AW 橙和霜橙莖段初代培養(yǎng)的適宜培養(yǎng)基。對(duì)感染CTV柑橘及其健康對(duì)照進(jìn)行離體培養(yǎng)，結(jié)果顯示CTV的侵染可以顯著影響離體培養(yǎng)柑橘的生長(zhǎng)發(fā)育和形態(tài)建成，除降低其腋芽萌發(fā)率、個(gè)數(shù)及高度外，還顯著降低了離體植

9、株的生根能力。在幼年態(tài)柑橘中，病毒侵染對(duì)香櫞的影響最為嚴(yán)重，墨西哥來檬居中，而對(duì)甜橙的影響相對(duì)較小；在成年態(tài)柑橘中，CTV 侵染對(duì)霜橙的影響最為嚴(yán)重。利用TAS-ELISA和免疫捕捉(IC-)RT-PCR及試管嫁接等方法，對(duì)不同培養(yǎng)時(shí)期離體植株中CTV效價(jià)和嫁接傳染力的變化動(dòng)態(tài)進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，病毒的效價(jià)和嫁接傳染力同離體植株的生長(zhǎng)勢(shì)存在一定的相關(guān)性，在前三次的繼代培養(yǎng)過程中，CTV的效價(jià)和嫁接傳染力均未發(fā)生明顯變化，但繼代培養(yǎng)15

10、次后，墨西哥來檬和甜橙離體植株中病毒的效價(jià)和嫁接傳染力均顯著降低，香櫞離體植株中病毒的效價(jià)甚至在繼代培養(yǎng)6次后就顯著下降。以上研究結(jié)果表明，不同柑橘品種對(duì)CTV的敏感程度存在差異，并且暗示了病毒的侵染誘導(dǎo)或抑制了寄主中某些跟生長(zhǎng)發(fā)育或抗性有關(guān)基因的表達(dá)。 4.以墨西哥來檬離體植株為研究體系，利用抑制差減雜交技術(shù)(SSH)構(gòu)建了CTV誘導(dǎo)寄主上調(diào)和下調(diào)表達(dá)文庫。通過反向Northern斑點(diǎn)雜交技術(shù)對(duì)兩個(gè)差減文庫進(jìn)行篩選，共獲得了2

11、03個(gè)差異表達(dá)片段。經(jīng)過DNA測(cè)序并在已知的核酸與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)文庫中共有180個(gè)unigene差異表達(dá)，其中CTV誘導(dǎo)寄主上調(diào)表達(dá)的基因80個(gè)，下調(diào)表達(dá)的基因100個(gè)。本研究在墨西哥來檬中分離鑒定出的180個(gè)ESTs片段，目前在柑橘中報(bào)道的僅有17個(gè)，其它絕大部分來源于擬南芥、煙草和番茄等。在180個(gè)ESTs片段中，50％尚不能推斷其功能，其余50％涉及抗病防御、轉(zhuǎn)錄、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、能量、代謝、蛋白質(zhì)合成等信號(hào)途徑，提示