EB病毒轉(zhuǎn)化淋巴母細(xì)胞的差異表達(dá)基因篩選.pdf

1、目的:檢測分析正常人淋巴細(xì)胞和體外EBV轉(zhuǎn)化淋巴母細(xì)胞兩者宿主細(xì)胞差異表達(dá)基因,篩選發(fā)現(xiàn)EBV誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的候選關(guān)鍵基因,探討EBV誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制。
　　方法:采集7例健康獻(xiàn)血員新鮮外周靜脈血,分離出人淋巴細(xì)胞,在體外利用EBV誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化建立淋巴母細(xì)胞模型,分別保存正常人淋巴細(xì)胞與體外EBV轉(zhuǎn)化淋巴母細(xì)胞。采用Agilent4×44K人類全基因組表達(dá)譜芯片檢測、比較分析正常人淋巴細(xì)胞與體外 EBV轉(zhuǎn)化淋巴母細(xì)

2、胞的宿主細(xì)胞差異表達(dá)基因,篩選出fold change≥2的基因?yàn)楸磉_(dá)顯著上調(diào)基因,fold change≤0.5為表達(dá)顯著下調(diào)基因。采用實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證基因芯片檢測結(jié)果。
　　結(jié)果:
　　1.EBV轉(zhuǎn)化后的淋巴細(xì)胞永生化,經(jīng)傳代培養(yǎng)和顯微鏡下觀察,獲得體外EBV轉(zhuǎn)化的淋巴母細(xì)胞模型。利用LIMMA算法以t test,p〈0.0001篩選差異表達(dá)基因,共篩選出2916個(gè)明顯差異表達(dá)Probes,其中上調(diào)基因1328個(gè),下調(diào)

3、基因1007個(gè),581個(gè)Probes在HUGO未映射有基因(含EST65個(gè)),系統(tǒng)構(gòu)建了7例同源正常淋巴細(xì)胞(Norm)和體外EBV轉(zhuǎn)化淋巴母細(xì)胞(Trans)的宿主細(xì)胞差異基因表達(dá)譜。 Hierarchical Clustering分析顯示,差異表達(dá)基因能夠很好地區(qū)分正常淋巴細(xì)胞和EBV轉(zhuǎn)化淋巴母細(xì)胞。
　　2.差異表達(dá)基因的生物信息學(xué)分析
　　Gene Ontology分類中BP分析顯示,共958個(gè)上調(diào)基因參與272個(gè)B

4、P分類,其中與細(xì)胞周期和有絲分裂相關(guān)的“M phase”,“cell cycle process”,“cell cycle phase”,“cell cycle”,“mitotic cell cycle”,“M phase of mitotic cell”,“mitosis”,“nuclear division”和“organelle fission”等10個(gè)BP分類 EASE score最低,均<5.1E-39。745個(gè)下調(diào)基因參與4

5、03個(gè) BP分類,其中與機(jī)體免疫與應(yīng)激相關(guān)的“immune response”,“defense response”,“cell activation”,“response to wounding”,“l(fā)eukocyte activation”,“positive regulation of biological process”,“inflammatory response”,“regulation of cell activatio

6、n”,“regulation of cell proliferation”和“regulation of leukocyte activation”等10個(gè)BP分類EASE Score得分最低,均<1.7E-9。
　　870個(gè)上調(diào)基因參與82個(gè)MF分類,其中主要涉及基因和蛋白結(jié)合活性,如“adenyl nucleotide binding”,“ATP binding”,“nucleoside binding”,“purine nu

7、cleoside binding”和“nucleotide binding”的EASE Score得分最低,均<2.6E-12。707個(gè)下調(diào)基因參與70個(gè)MF分類,其中主要涉及分子信號(hào)與細(xì)胞因子受體結(jié)合,如“molecular transducer activity”,“signal transducer activity”,“receptor activity”,“protein binding”和“cytokine binding”

8、等,共有20個(gè)EASE Score小于0.001。
　　利用“KEGG Pathway”,“BioCarta”和“Reactome”數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Pathway分析顯示,當(dāng) EASE Score<0.05時(shí),上調(diào)基因中321個(gè)基因參與25條“KEGG-pathway”,49個(gè)基因參與7條“BioCarta-pathway”,340個(gè)基因參與12條“Reactome-pathway”。下調(diào)基因中256個(gè)基因參與12條“KEGG-path

9、way”,94個(gè)基因參與15條“BioCarta-pathway”,120個(gè)基因參與4條“Reactome-pathway”。
　　將上調(diào)和下調(diào)差異表達(dá)基因涉及的生物學(xué)功能進(jìn)行“Functional Annotation Clustering”分析,結(jié)果顯示上調(diào)基因涉及的生物學(xué)功能分類聚集為73個(gè)集合,其中Enrichment Score分?jǐn)?shù)最高的功能集合主要涉及細(xì)胞周期和細(xì)胞分裂;下調(diào)基因涉及的生物學(xué)功能分類聚集為71個(gè)集合,E

10、nrichment Score分?jǐn)?shù)最高的功能集合主要涉及細(xì)胞凋亡。
　　利用STRING,GENERANK,PATHWAY及GO分類等生物信息學(xué)軟件綜合分析差異表達(dá)基因,并按照基因的權(quán)重度排序,分選出排序前100位差異表達(dá)基因,其中上、下調(diào)基因各50個(gè)。對此100個(gè)基因進(jìn)行生物學(xué)功能分析及預(yù)測,上調(diào)基因IGF1,GOT2,GOT1,AURKB,CDK2,AURKA,BRCA1,PLK1,KIF20A,KIF18B等主要參與“cel

11、l cycle”,“mitosis”,“protein biosynthesis”,“chromosomesegregation”等生物學(xué)過程;上調(diào)基因E2F1,PTPN11,PIK3R3,PLCG2,下調(diào)基因FOS,PXN,PRKCQ,FYN,ZAP70,PROK2,FCN1,HCK等則與腫瘤相關(guān)信號(hào)通路密切相關(guān),如“P53 pathway”,“Angiogenesis”,“VEGF signaling pathway”,“FGF s

12、ignaling pathway”,“IGF pathway-protein kinase B signaling cascade”等;下調(diào)基因CD3G,CD3D,CD247,S100A8,CD4,GZMA,ITK,CLU,GZMH,GZMK等主要與細(xì)胞凋亡、機(jī)體免疫調(diào)節(jié)、應(yīng)激等生物學(xué)過程有關(guān),如“apotosis”,“T/B cell activation”,“immune system process”,“response to s

13、timulus”等。其中部分基因如E2F1,PLK1,PTPN11,FOS,IGF1,CDK2等參與多種生物學(xué)行為。
　　3.綜合信號(hào)通路、基因生物學(xué)分類、基因間相互作用分析與預(yù)測結(jié)果,提示EBV可上調(diào)宿主細(xì)胞E2F1,PLK1,BIRC5等調(diào)控細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡;上調(diào)宿主細(xì)胞PTPN11等促進(jìn)腫瘤血管生成與分化;下調(diào)宿主細(xì)胞FYN等降低宿主細(xì)胞免疫功能。
　　4.實(shí)時(shí)定量PCR檢測結(jié)果顯示:經(jīng)內(nèi)參校正后,與正常人淋巴細(xì)胞相

14、比,E2F1,PTPN11,PLK1,BIRC5轉(zhuǎn)錄水平在EBV轉(zhuǎn)化淋巴母細(xì)胞表達(dá)上調(diào);FYN轉(zhuǎn)錄水平在轉(zhuǎn)化淋巴母細(xì)胞表達(dá)下調(diào),結(jié)果與基因芯片檢測結(jié)果一致。
　　結(jié)論:
　　1.首次構(gòu)建了正常人淋巴細(xì)胞和體外EBV轉(zhuǎn)化淋巴母細(xì)胞的差異基因表達(dá)譜,首次發(fā)現(xiàn)正常淋巴細(xì)胞和轉(zhuǎn)化淋巴母細(xì)胞的宿主細(xì)胞基因表達(dá)模式存在明顯差異。
　　2.表明EBV轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞是一個(gè)多基因參與,多通路涉及、病毒基因與宿主基因相互作用的過程。推測EB