褐飛虱Dnmt1和N6amt2的表達(dá)和功能分析及甜菜夜蛾RNA干擾致死基因的克隆.pdf

1、褐飛虱（Nilaparvata lugens）是一種單食性昆蟲，只為害水稻，種群繁殖速度快，繁殖量大，是我國及許多東南亞、東北亞國家和地區(qū)水稻生產(chǎn)上的重要害蟲。表觀遺傳修飾可在不改變基因組DNA的情況下調(diào)控生物體多種生命活動(dòng)。本論文對(duì)褐飛虱中2個(gè)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶及其相關(guān)蛋白基因的cDNA全長(zhǎng)進(jìn)行了克隆，開展了2個(gè)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因的基因結(jié)構(gòu)和分子進(jìn)化分析。通過數(shù)據(jù)庫及基因組搜索，研究了不同物種中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶種類的分布情況。本論文的

2、研究對(duì)理解褐飛虱DNA甲基化的表觀遺傳修飾具有重要的意義。對(duì)近年來給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成重大損失的雜食性害蟲——甜菜夜蛾的潛在的RNA干擾致死基因進(jìn)行克隆，對(duì)新害蟲防治手段的研究具有重要的意義。
　　1.褐飛虱Dnmt1、N6amt2及DMAP1的全長(zhǎng)克隆
　　克隆得到褐飛虱2個(gè)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因和1個(gè)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶相關(guān)蛋白基因即DNA(cytosine-5-)-methyltransferase1(Dnmt1), N6-ade

3、nine-specific DNA methyltrans-ferase2(N6amt2)和DNA methyltransferase1-associated protein(DMAP1)的cDNA全長(zhǎng)序列，并對(duì)3個(gè)基因氨基酸序列的等電點(diǎn)、分子量及蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析。三條序列的GenBank登錄號(hào)分別為KF294265，KF294266，KF294267。
　　2.褐飛虱Dnmt1和N6amt2的基因結(jié)構(gòu)和分子進(jìn)化分析

4、　　分別從蛋白結(jié)構(gòu)域、序列相似性、基因結(jié)構(gòu)及進(jìn)化4個(gè)方面對(duì)褐飛虱的Dnmt1和N6amt2基因進(jìn)行了分析。對(duì)Dnmt1基因的分析表明，褐飛虱與人、小鼠、非洲爪蟾及斑馬魚具有完全相同的結(jié)構(gòu)域。不同物種Dnmt1中的結(jié)構(gòu)域序列具有很高的相似性，褐飛虱與非洲爪蟾和斑馬魚相似性為75％，與意大利蜜蜂和人相似性為74％，表明結(jié)構(gòu)域具有保守的重要催化活性。不同物種間Dnmt1基因長(zhǎng)度相差很大，內(nèi)含子和外顯子的數(shù)量及長(zhǎng)度也有很大差別。
　　對(duì)N

5、6amt2基因的分析表明，不同物種的催化活性結(jié)構(gòu)域中都含有QFW motif和DPPF motif。褐飛虱與意大利蜜蜂、家蠶和豌豆蚜的序列相似性最高，分別為74％、69％和65％。與Dnmt1基因類似，N6amt2基因長(zhǎng)度相差也比較大，但其內(nèi)含子和外顯子的數(shù)量及長(zhǎng)度差別不大。
　　系統(tǒng)進(jìn)化分析的結(jié)果表明，褐飛虱的Dnmt1及N6amt2均與昆蟲中的同源基因具有較近的進(jìn)化距離。分析表明，褐飛虱同哺乳動(dòng)物及膜翅目昆蟲類似，具有完整的D

6、nmt基因家族，部分昆蟲丟失了Dnmt3，雙翅目昆蟲只有Dnmt2。昆蟲中都含有N6amt2基因。
　　3.褐飛虱不同發(fā)育階段及不同翅型種群Dnmt1和N6amt2的表達(dá)分析
　　選取普通種群1至5齡若蟲、長(zhǎng)翅型未產(chǎn)卵雌蟲和產(chǎn)卵盛期雌蟲、短翅型未產(chǎn)卵雌蟲和產(chǎn)卵盛期雌蟲及長(zhǎng)、短翅型雄蟲共11個(gè)樣本進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，Dnmt1和N6amt2的表達(dá)量在若蟲階段沒有明顯差異，但兩個(gè)基因在成蟲階段表達(dá)量差異明顯，達(dá)顯著水平。無論是

7、長(zhǎng)翅型還是短翅型成蟲，Dnmt1和N6amt2在未產(chǎn)卵雌蟲中表達(dá)量均明顯低于處于產(chǎn)卵盛期的雌蟲表達(dá)量。兩個(gè)基因在未產(chǎn)卵和產(chǎn)卵盛期雌蟲的表達(dá)量均高于雄蟲。
　　選取普通種群中不同日齡的長(zhǎng)翅型和短翅型雌、雄蟲，對(duì)成蟲Dnmt1和N6amt2的表達(dá)情況開展了分析。結(jié)果表明，不同翅型和性別的成蟲中兩個(gè)基因的表達(dá)量大多呈先上升后下降的趨勢(shì)，且兩個(gè)基因在雌蟲中的表達(dá)量均明顯高于雄蟲。這些結(jié)果顯示，DNA甲基化可能參與調(diào)控褐飛虱雌蟲的生殖發(fā)育。

8、
　　利用實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期維護(hù)的褐飛虱長(zhǎng)翅型和短翅型種群進(jìn)行進(jìn)一步分析。結(jié)果表明，兩個(gè)翅型種群的若蟲Dnmt1和N6amt2表達(dá)量從1齡至5齡均呈下降趨勢(shì);Dnmt1在短翅型種群中表達(dá)量高于長(zhǎng)翅型種群，而N6amt2在長(zhǎng)、短翅型種群中的表達(dá)量無明顯差異。
　　4.褐飛虱Dnmt1和N6amt2的RNA干擾分析
　　根據(jù)褐飛虱Dnmt1和N6amt2的序列設(shè)計(jì)并合成了dsRNA，利用飼喂法對(duì)褐飛虱2齡末若蟲進(jìn)行RNA干擾實(shí)驗(yàn)，

9、利用qRT-PCR檢測(cè)RNA干擾后不同時(shí)間點(diǎn)2個(gè)基因的表達(dá)量變化情況，結(jié)果顯示干擾后Dnmt1的表達(dá)量與對(duì)照組相比竟然有所升高，尤其是第1、2、10、15天的表達(dá)量升高更為明顯，而在第5、7天表達(dá)量?jī)H有略微升高;干擾后N6amt2的表達(dá)量與對(duì)照組相比在第1天明顯升高，但從第2天開始表達(dá)量開始持續(xù)下降，直至第10天下降最明顯，約下降了62％。兩個(gè)基因的干擾組與對(duì)照組相比均未出現(xiàn)表型異常的個(gè)體。關(guān)于Dnmt1和N6amt2基因的功能尚需深入

10、研究。
　　5.甜菜夜蛾RNA干擾致死基因的克隆
　　對(duì)篩選出的4個(gè)甜菜夜蛾潛在的RNA干擾致死基因（arf1，arf2，tubulin1，tubulin2）進(jìn)行了cDNA克隆。獲得arf2的cDNA全長(zhǎng)及arf1、tubulin1和tubulin2的完整CDS序列。4條基因序列已提交至GenBank，登錄號(hào)分別為JF915770，JQ653045，JQ653042，JQ653043。對(duì)4個(gè)基因氨基酸序列的等電點(diǎn)、分子量及蛋