三疣梭子蟹CYP2和GST基因的cDNA克隆與表達(dá)分析.pdf

1、水產(chǎn)品藥物的殘留給人類健康和環(huán)境帶來(lái)了很大的危害。而藥物在生物體內(nèi)的轉(zhuǎn)化離不開(kāi)藥物代謝酶的參與，其活性的誘導(dǎo)或抑制會(huì)導(dǎo)致藥物的相互作用，從而影響藥物的殘留或影響藥效。已有研究表明生物體內(nèi)重要的藥物代謝酶有一相代謝酶細(xì)胞色素P450酶系（CYP450s）和二相代謝酶谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶系（GSTs）。然而，關(guān)于海洋甲殼動(dòng)物中藥物代謝酶相關(guān)基因以及水產(chǎn)藥物對(duì)其表達(dá)水平和酶活性影響的研究卻非常少。本文以此為切入點(diǎn)，以我國(guó)重要的養(yǎng)殖蟹類-三疣梭子

2、蟹（Portunus trituberculatus）為研究對(duì)象，研究磺胺二甲嘧啶SM2、磺胺嘧啶SD和磺胺間甲氧嘧啶SMM等短、中、長(zhǎng)三種磺胺類藥物對(duì)CYP2和GST基因表達(dá)以及酶活性的影響。為研究海洋甲殼動(dòng)物藥物代謝酶基因的功能提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，同時(shí)為磺胺類藥物在水產(chǎn)上的安全使用提供技術(shù)支持。本論文主要研究?jī)?nèi)容共分為以下三部分：
　　第一部分：以三疣梭子蟹“黃選1號(hào)”為研究對(duì)象，通過(guò)簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增及SMARTTM RACE擴(kuò)增獲得三

3、疣梭子蟹細(xì)胞色素P450（CYP2）基因cDNA全長(zhǎng)為1662bp（GenBank登錄號(hào)：KF781516），包含1479bp的開(kāi)放閱讀框（ORF），編碼一個(gè)由492個(gè)氨基酸組成的多肽，預(yù)測(cè)理論等電點(diǎn)PI為6.348，分子量大小為56.68kDa。氨基酸序列中含有CYP基因家族特有的K螺旋保守序列（ExxR）和血紅素結(jié)合區(qū)（FxxGxxxCxG）。同源性及系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，三疣梭子蟹 CYP2基因與岸蟹（Carcinus maenas）

4、和佛羅里達(dá)龍蝦（Panulirus argus）的同源性分別為75％和39%。熒光定量RT-PCR結(jié)果表明，CYP2基因在肝胰腺、鰓、心臟、肌肉、眼柄和血淋巴中都有表達(dá)。在肝胰腺中表達(dá)量最高（P<0.01），其次是鰓（P<0.01），在血淋巴中表達(dá)最少。本實(shí)驗(yàn)用SM2、SD和SMM三種不同濃度磺胺藥物刺激三疣梭子蟹CYP2基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)此三種磺胺藥物在CYP2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平上有影響，均可誘導(dǎo)肝胰腺中CYP2基因的表達(dá)。在SM2各劑

5、量組對(duì)CYP2基因的表達(dá)量不太顯著，只在高濃度組對(duì)其有顯著誘導(dǎo)效應(yīng)（P<0.05）。SD和SMM各劑量組對(duì)CYP2基因的表達(dá)量有極顯著誘導(dǎo)效應(yīng)（P<0.01），并且在SD各劑量組隨給藥劑量越大，CYP2基因上調(diào)水平越高，且出現(xiàn)的峰值越晚。結(jié)果表明，三種磺胺藥物可使 CYP2表達(dá)量升高，說(shuō)明其對(duì) CYP2有誘導(dǎo)作用，揭示了磺胺藥物與 CYP2酶的底物藥物合用時(shí)，很可能會(huì)發(fā)生藥物的相互作用，應(yīng)適當(dāng)調(diào)整用量，避免使藥物達(dá)不到療效。
　　

6、第二部分，克隆了三疣梭子蟹谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）基因cDNA全長(zhǎng)序列（登錄號(hào)：KF781517）。該基因全長(zhǎng)1010bp，包含651bp的開(kāi)放閱讀框（ORF），編碼一個(gè)由216個(gè)氨基酸組成的多肽，預(yù)測(cè)理論等電點(diǎn)PI為5.294，分子量大小為24.59kDa。氨基酸序列中含有GST基因家族特有GST-N結(jié)構(gòu)域和GST-C結(jié)構(gòu)域。同源性及系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，三疣梭子蟹GST基因與中華絨螯蟹（Eriocheir sinesis）和脊尾白蝦

7、（Exopalaemon carinicauda）的同源性分別為78%和63%。熒光定量 RT-PCR結(jié)果表明，GST在肝胰腺、鰓、心臟、肌肉、眼柄和血淋巴中都有表達(dá)，在肝胰腺中表達(dá)量最高（P<0.01），其次是鰓（P<0.01），在心臟中表達(dá)最少。本實(shí)驗(yàn)用SM2、SD和SMM三種不同濃度磺胺藥物刺激三疣梭子蟹 GST基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)此三種磺胺藥物在 GST mRNA轉(zhuǎn)錄水平上有影響，且呈現(xiàn)時(shí)間效應(yīng)。在實(shí)驗(yàn)的1、3、6h均呈現(xiàn)先小幅度升

8、高（P<0.01），這表明在外源藥物的刺激下生物體表現(xiàn)出一定的誘導(dǎo)作用，說(shuō)明此誘導(dǎo)使生物體的解毒能力增加。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)在12和18h呈現(xiàn)下降趨勢(shì)（P<0.01），這表明隨著外源藥物的刺激，生物體GST表達(dá)量受到抑制作用誘導(dǎo)作用說(shuō)明此時(shí)藥物已經(jīng)嚴(yán)重破了壞肝細(xì)胞的功能。在實(shí)驗(yàn)的24和48h，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GST基因的相對(duì)表達(dá)量急劇升高（P<0.01），這可能是生物體肝細(xì)胞的解毒功能得到恢復(fù)且其解毒能力更強(qiáng)。之后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，藥物在體內(nèi)代

9、謝量逐漸降低，GST基因的相對(duì)表達(dá)量恢復(fù)至對(duì)照組。各藥物組在高濃度的脅迫下此反應(yīng)趨勢(shì)更加明顯。
　　第三部分，研究了SM2、SD和SMM三種水產(chǎn)用磺胺類藥物對(duì)三疣梭子蟹肝胰腺組織中氨基比林N-脫甲基酶(APND)和GST活性的影響；結(jié)果表明，和對(duì)照組相比，三種磺胺類藥物對(duì)三疣梭子蟹肝胰腺S9中APND活性均具有誘導(dǎo)作用，其中SM2誘導(dǎo)效應(yīng)最弱，只在實(shí)驗(yàn)前期出現(xiàn)顯著誘導(dǎo)效應(yīng)(P<0.05)。而其他兩種藥物出現(xiàn)極顯著的誘導(dǎo)效應(yīng)(P<0