miR-315通過靶向dfmrl來調(diào)節(jié)突觸發(fā)育和功能.pdf

1、脆性X綜合癥(fragile X syndrome,FXS)是最常見的遺傳性智力低下疾病之一,由FMR1基因突變致使脆性X智力低下蛋白(fragile X mental retardation protein,FMRP)功能缺失所致。MicroRNAs(miRNAs)是一類非編碼的單鏈RNA,其在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)。近年的研究表明FMRP和miRNA調(diào)控通路之間在基因調(diào)控水平存在相互作用:一是,FMRP可以與特定的miRNA結(jié)合,進(jìn)

2、而將miRNA募集到FMRP靶標(biāo)mRNA上,調(diào)節(jié)其靶標(biāo)mRNA的翻譯；二是,FMRP可以與Dicer相互作用,調(diào)節(jié)由pre-miRNA生成成熟miRNA的過程。對于FMRP是否會受到miRNA的調(diào)控,目前還沒有文獻(xiàn)報(bào)道。對這種作用機(jī)制的研究可以為脆性X綜合癥的分子發(fā)病機(jī)制提供更為深入的了解。
　　 本文以dFMRP為出發(fā)點(diǎn),尋找能夠調(diào)控dFMRP的miRNAs,從而進(jìn)一步研究dFMRP受到miRNAs調(diào)控后,對果蠅生長發(fā)育的影響

3、。
　　 首先,通過生物信息學(xué)預(yù)測,我們發(fā)現(xiàn)果蠅中存在多種miRNAs可以調(diào)控dfmr1,其中miR-315與dfmr13’UTR配對效果最好,調(diào)控dfmr1的可能性較大。研究發(fā)現(xiàn)miR-315在黑腹果蠅(D.melanogaster)的胚胎、幼蟲、成蟲中持續(xù)表達(dá),且主要表達(dá)在大腦和腹神經(jīng)索(VNC)。果蠅S2細(xì)胞內(nèi)的結(jié)果顯示,miR-315對dfmrl存在明顯的調(diào)控作用。利用GFP傳感器(GFP Sensor)實(shí)驗(yàn),在果蠅體內(nèi)

4、水平進(jìn)一步證實(shí)miR-315可以直接作用于dfmr1的3'UTR。經(jīng)免疫染色實(shí)驗(yàn)證明,miR-315在體內(nèi)可以抑制dFMRP的表達(dá)。
　　 其次,通過UAS／Ga14系統(tǒng),在果蠅體內(nèi)過表達(dá)miR-315會導(dǎo)致果蠅幼蟲發(fā)育異常,停留在蛹前期不再發(fā)育。
　　 進(jìn)一步研究,我們發(fā)現(xiàn)在果蠅幼蟲神經(jīng)肌肉接頭(NMJ)部位,miR-315的過表達(dá)會引起mini-bouton數(shù)量增加、bouton area增大,與dfmr1突變體表型

5、一致,但在branchnumber和bouton number方面未出現(xiàn)與dfmr1突變體類似表型。通過對NMJ的細(xì)胞骨架研究,我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)miR-315過表達(dá)時果蠅幼蟲NMJ的細(xì)胞骨架中出現(xiàn)了空泡樣結(jié)構(gòu)(Futsch+loops)分布無序且增多的現(xiàn)象,在dfmr1突變體中我們也觀察到了同樣的變化。
　　 在突觸功能方面,我們發(fā)現(xiàn)在miR-315過表達(dá)的情況下,mEJP的頻率與對照相比明顯增加,說明miR-315通過調(diào)控dfmr1

6、影響了突觸囊泡的釋放。我們進(jìn)一步研究了導(dǎo)致這種突觸囊泡釋放加快的機(jī)制,發(fā)現(xiàn)突觸活性中心(Activezone)沒有異常,但是突觸囊泡的數(shù)量出現(xiàn)上升。說明mEJP頻率的增加是由于突觸囊泡的數(shù)量上升所導(dǎo)致。
　　 通過對miR-315調(diào)控dfmr1的研究,我們發(fā)現(xiàn)在miR-315過表達(dá)的情況下,果蠅幼蟲出現(xiàn)了一系列的發(fā)育異常和NMJ結(jié)構(gòu)上的改變,NMJ的突觸功能也出現(xiàn)了變化,使我們對miRNA在脆性X綜合癥中的作用有了初步了解,對脆