DRAM1通過溶酶體調(diào)節(jié)自噬和細(xì)胞凋亡.pdf

1、目的：碩士期間的研究工作表明，大鼠紋狀體內(nèi)給予線粒體毒素3-硝基丙酸(3-NP)引起的紋狀體神經(jīng)元死亡伴有自噬和凋亡激活，p53誘導(dǎo)的DRAM1表達(dá)在自噬激活和細(xì)胞死亡中有重要作用。本論文研究DRAM1調(diào)節(jié)細(xì)胞線粒體失能引起的自噬激活和細(xì)胞死亡的分子機(jī)制。
　　 方法：(1)建立3-NP所致A549細(xì)胞線粒體失能毒性模型。3-NP處理細(xì)胞24，48和72h后，Western blot法測(cè)定DRAM1，BAX，p62和LC3等凋亡

2、和自噬蛋白的表達(dá)和線粒體細(xì)胞色素C的釋放，免疫熒光法檢測(cè)LC3的表達(dá)，觀察自噬和凋亡通路的激活。(2)觀察自噬和凋亡過程在3-NP所致的細(xì)胞線粒體毒性引起的細(xì)胞死亡中的作用。Western blot法檢測(cè)Atg5的siRNA干擾效果。WST-1法檢測(cè)Atg5 siRNA干擾和Z-VAD-FMK對(duì)3-NP誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的影響。(3)檢測(cè)DRAM1在3-NP誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬流量變化中的作用。Western Blot法檢測(cè)DRAM1的siRNA

3、后觀察p62，LC3等自噬蛋白的表達(dá)。免疫組化法檢測(cè)DRAM1蛋白下調(diào)后3-NP所致的LC3的表達(dá)的變化。(4)研究DRAM1調(diào)節(jié)3-NP誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬流量的作用機(jī)制。免疫熒光雙標(biāo)法觀察DRAM1和溶酶體標(biāo)志物L(fēng)ysoTracker在細(xì)胞內(nèi)的共定位情況。為了觀察DRAM1在細(xì)胞清除自噬-溶酶體中的作用，野生型細(xì)胞和DRAM1 siRNA干擾細(xì)胞分別用雷帕霉素處理24h以及處理6h后撤去雷帕霉素，再采用Western blot法檢測(cè)LC3

4、的蓄積情況，并對(duì)LC3點(diǎn)狀聚集進(jìn)行量化，免疫組化法觀察LC3和Lamp2檢測(cè)在胞質(zhì)內(nèi)的降解情況。為了觀察DRAM1影響自噬體的降解機(jī)制，用Western blot法檢測(cè)Cathepsin D的激活以及使用分子探針觀察氫質(zhì)子泵和溶酶體的酸化情況。(5)驗(yàn)證DRAM1是通過溶酶體來調(diào)節(jié)自噬流量。使用溶酶體抑制劑E64d和氯喹抑制溶酶體后觀察是否會(huì)產(chǎn)生LC3的蓄積，采用Western blot法觀察了抑制溶酶體后Cathepsin D的變化，

5、以及用WST-1法觀察是否會(huì)影響細(xì)胞活力。(6)檢測(cè)DRAM1在3-NP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程中的作用。Western Blot法觀察DRAM1表達(dá)降低后BAX的表達(dá)和線粒體細(xì)胞色素C的釋放以及caspase-3的激活。(7)檢測(cè)DRAM1調(diào)節(jié)3-NP所致細(xì)胞凋亡的機(jī)制。Western Blot法驗(yàn)證BAX siRNA干擾和過表達(dá)的效率。為了觀察BAX在DRAM1調(diào)節(jié)凋亡中的作用機(jī)制，采用Western Blot法觀察BAX的表達(dá)降低后對(duì)于

6、Cathepsin D和casepase3的激活以及細(xì)胞色素C的釋放的影響。WST-1法檢測(cè)BAX表達(dá)降低后對(duì)3-NP引起的細(xì)胞死亡的影響。
　　 結(jié)果：(1)在不同時(shí)間點(diǎn)3-NP所致A549細(xì)胞線粒體失能毒性模型中，Western blot和免疫熒光結(jié)果顯示DRAM1，LC3自噬相關(guān)蛋白在24-48h達(dá)到高峰(p<0.01)，自噬底物蛋白p62蓄積減少(p<0.01)。同時(shí)，凋亡相關(guān)蛋白BAX和細(xì)胞色素C的釋放在48-72h達(dá)

7、到高峰(p<0.01)。表明自噬和凋亡過程都被激活。(2)Western blot結(jié)果顯示Atg5 siRNA干擾后，Atg5蛋白表達(dá)明顯降低(p<0.01)。WST-1法結(jié)果顯示Atg5表達(dá)降低和Z-VAD-FMK處理對(duì)3-NP所致細(xì)胞死亡有顯著抑制作用。表明自噬和凋亡過程同時(shí)參與了3-NP誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。(3)Western blot結(jié)果顯示DRAM1的siRNA干擾效果明顯(p<0.01)，并且觀察到DRAM1蛋白表達(dá)降低后對(duì)3-

8、NP所致自噬相關(guān)蛋白LC3的升高有明顯抑制作用(p<0.01)，自噬底物蛋白p62表達(dá)升高(p<0.01)。說明siRNA干擾DRAM1后細(xì)胞自噬流量降低。(4)免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果顯示DRAM1和溶酶體標(biāo)志物L(fēng)ysoTracker在胞質(zhì)內(nèi)的共定位情況明顯。雷帕霉素處理24h組和處理6h后撤去雷帕霉素組的結(jié)果顯示，siRNA干擾DRAM1細(xì)胞組在撤去雷帕霉素后LC3和Lamp2的消除情況明顯比野生型細(xì)胞要緩慢。LC3的量化結(jié)果表明了siRN

9、A干擾DRAM1組LC3-Ⅱ在撤除雷帕霉素后下降減慢。Western blot結(jié)果顯示siRNA干擾DRAM1對(duì)3-NP所致Cathepsin D的激活有明顯抑制作用(p<0.01)。說明siRNA干擾DRAM1細(xì)胞對(duì)比野生型細(xì)胞對(duì)胞內(nèi)自噬溶酶體的清除能力降低。溶酶體酸化指示劑和量化結(jié)果顯示siRNA干擾DRAM1對(duì)3-NP所致的溶酶體酸化程度降低(p<0.01)。氫質(zhì)子泵結(jié)果顯示siRNA干擾DRAM1對(duì)3-NP所致的氫質(zhì)子泵的激活有

10、抑制作用。說明siRNA干擾DRAM1的細(xì)胞溶酶體酸化作用降低，清除自噬溶酶體能力減弱。(5)免疫熒光雙染結(jié)果顯示，當(dāng)線粒體毒性藥物3-NP處理后，LC3和Lamp2表達(dá)明顯增加，并且共定位現(xiàn)象明顯。E64d和氯喹處理后，LC3和Lamp2蓄積明顯增加。Western blot結(jié)果表明3-NP誘導(dǎo)的LC3Ⅱ在E64d處理后顯著上升(p<0.05)，3-NP誘導(dǎo)的LC3Ⅱ在氯喹處理后也有顯著上升(p<0.01)。Western blot結(jié)

11、果表明在E64d和氯喹處理后3-NP誘導(dǎo)的細(xì)胞色素C從線粒體內(nèi)的釋放顯著減少(p<0.01)。WST-1結(jié)果顯示W(wǎng)T細(xì)胞在溶酶體抑制劑處理后，細(xì)胞活力沒有很明顯的變化(p>0.05)，但是顯著抑制了3-NP導(dǎo)致的細(xì)胞死亡(p<0.05)。說明抑制了溶酶體就抑制了自噬的流量和3-NP誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，而DRAM1就是通過溶酶體來達(dá)到調(diào)節(jié)自噬流量的作用。(6)Western blot法結(jié)果顯示DRAM1蛋白siRNA干擾后對(duì)3-NP所致BAX

12、凋亡蛋白升高有明顯抑制作用(p<0.01)，線粒體細(xì)胞色素C的釋放減少(p<0.01)，caspase-3的激活減少(p<0.01)。(7)Western blot結(jié)果顯示BAX siRNA干擾后，BAX蛋白表達(dá)明顯下降(p<0.01)。Westernblot結(jié)果顯示，細(xì)胞內(nèi)BAX表達(dá)降低會(huì)抑制3-NP誘導(dǎo)的Cathepsin D和casepase3的激活(p<0.01)和3-NP誘導(dǎo)的細(xì)胞色素C的釋放(p<0.01)。WST-1結(jié)果顯

13、示BAX的siRNA對(duì)3-NP所致的細(xì)胞死亡有明顯抑制作用(p<0.01)。說明DRAM1有可能通過BAX來調(diào)節(jié)3-NP誘導(dǎo)的凋亡過程。
　　 結(jié)論：本文研究結(jié)果表明：DRAM1通過促進(jìn)溶酶體酸化和激活溶酶體酶來調(diào)節(jié)自噬流量，同時(shí)DRAM1通過上調(diào)BAX來調(diào)節(jié)線粒體介導(dǎo)的凋亡通路。
　　 正在進(jìn)行中的工作：
　　 自噬體和溶酶體的融合對(duì)于自噬體的降解是一個(gè)很重要的過程，因此對(duì)于深刻的了解DRAMI在自噬體和溶酶體