小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的IGF-1對新生大鼠腦缺血損傷修復(fù)的影響.pdf

1、背景：
　　 成體神經(jīng)發(fā)生終身存在于側(cè)腦室室管膜下區(qū)(subventricularzone，Svz)和海馬齒狀回(dentategyrus，DG)等腦內(nèi)某些特定區(qū)域，成體神經(jīng)干細(xì)胞(adultneuralstemcells，ANSCs)在腦內(nèi)的增殖和向著特定表型分化是由它們存在的小生境的特性決定的。在細(xì)胞水平，小膠質(zhì)細(xì)胞、星型膠質(zhì)細(xì)胞、室管膜細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞作為ANSCs小生境(niche)的組成部分已有不少的證據(jù);神經(jīng)免疫系

2、統(tǒng)的組成被提議作為ANSCs的小生境的組成部分影響ANSCs的增殖、分化和/或存活。大腦免疫細(xì)胞(尤其是小膠質(zhì)細(xì)胞和星型膠質(zhì)細(xì)胞)、外周免疫細(xì)胞(尤其是T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)、神經(jīng)元和成體神經(jīng)干細(xì)胞相互作用，維持大腦內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和自我更新，特別是先天免疫反應(yīng)，尤其是小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫網(wǎng)絡(luò)作為ANSCs小生境最重要的組成部分而引人注目。
　　 小膠質(zhì)細(xì)胞是定居在大腦實質(zhì)的巨噬細(xì)胞，它們來自中胚層，而不像其它經(jīng)典神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞來自外胚層

3、，而是源自在大腦發(fā)育中侵入的單核細(xì)胞。近年來原林教授提出支持儲備系統(tǒng)及自體監(jiān)控系統(tǒng)新學(xué)說，認(rèn)為由中胚層間充質(zhì)分化成多個器官系統(tǒng)后，所遺留的部分形成遍布全身結(jié)締組織筋膜支架，筋膜以干細(xì)胞為中心為其它功能細(xì)胞的再生提供細(xì)胞支持和儲備-稱之為支持儲備系統(tǒng);該系統(tǒng)在神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的參與下維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和功能狀態(tài)的調(diào)控-稱之自體監(jiān)控系統(tǒng)。小膠質(zhì)細(xì)胞作為ANSCs的支持細(xì)胞和小生境細(xì)胞，主導(dǎo)神經(jīng)免疫網(wǎng)絡(luò)，與ANSCs相互作用，維持ANSC

4、s的自我更新和促使神經(jīng)發(fā)生調(diào)控信號傾向，這類小膠質(zhì)細(xì)胞存在ANSCs的小生境中，形成小膠質(zhì)細(xì)胞免疫網(wǎng)絡(luò)與ANSCs相互作用，其缺乏經(jīng)典M1小膠質(zhì)細(xì)胞表型卻獨(dú)具M(jìn)2小膠質(zhì)細(xì)胞表型特性，作為ANSCs的支持細(xì)胞和小生境細(xì)胞維持大腦內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和自我更新。
　　 當(dāng)腦缺血損傷時，小膠質(zhì)細(xì)胞最早參與其炎癥反應(yīng)，小膠質(zhì)細(xì)胞在腦缺血損傷中扮演的是促神經(jīng)發(fā)生或神經(jīng)保護(hù)表型還是神經(jīng)毒性表型是近年神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域爭論最激烈的話題。眾所周知，小膠質(zhì)細(xì)胞

5、在不同的條件扮演著神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)毒性的雙重角色，究竟是哪種角色，那就要看他們當(dāng)時的激活狀態(tài)和功能表型，雖然早些研究顯示小膠質(zhì)細(xì)胞涉及抑制神經(jīng)發(fā)生，抑制神經(jīng)發(fā)生的機(jī)制是通過介導(dǎo)促炎因子和趨化因子的產(chǎn)生如IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-18、單核細(xì)胞趨化蛋白1和各種各樣的氫和氮類的反應(yīng)?？墒乾F(xiàn)在越來越多的證據(jù)證實小膠質(zhì)細(xì)胞作為促神經(jīng)發(fā)生表型在生理和一定的病理條件下支持神經(jīng)發(fā)生的不同階段，小膠質(zhì)細(xì)胞通過表達(dá)主要組織相容性抗原復(fù)合物II

6、、IFN-γ、IL-4、TGF-β1和產(chǎn)生神經(jīng)營養(yǎng)因子IGF-1、NGF、BDNF、NT-3、GDNF促使神經(jīng)發(fā)生。
　　 新生大鼠出生前后，SVZ和DG區(qū)神經(jīng)發(fā)生持續(xù)存在，在出生后7天達(dá)高峰，可是隨著年齡的增加，神經(jīng)發(fā)生增殖能力不斷減弱;當(dāng)新生大鼠在缺血缺氧腦損傷后，神經(jīng)發(fā)生增殖能力再次增強(qiáng)。大鼠出生后新生神經(jīng)元凋亡和缺血損傷后可以激活A(yù)NSCs的機(jī)制尚不清楚，有學(xué)者認(rèn)為大鼠出生后新生神經(jīng)元凋亡是由于神經(jīng)發(fā)生區(qū)域神經(jīng)營養(yǎng)因子支

7、持不足所致，病理損傷后可以上調(diào)神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)促使神經(jīng)發(fā)生。本實驗使用7日齡新生大鼠雙側(cè)頸總動脈夾閉10min，建立新生大鼠短暫腦缺血模型(BilateralCommonCarotidArteryOcclusion,BCCAO)，誘導(dǎo)神經(jīng)發(fā)生區(qū)域DG和SVZ區(qū)的神經(jīng)發(fā)生，通過觀察缺血早期DG區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化，和觀察缺血不同時間點(diǎn)DG區(qū)和SVZ區(qū)神經(jīng)營養(yǎng)因子IGF-1和ANSCs的增殖變化，最后使用IGF-1受體阻斷劑，阻斷I

8、GF-1的表達(dá)，再次觀察DG區(qū)和SVZ區(qū)的ANSCs增殖變化，為臨床治療腦血管疾病提供新的策略。
　　 目的：
　　 研究7日齡新生大鼠短暫腦缺血誘導(dǎo)神經(jīng)發(fā)生，觀察小膠質(zhì)細(xì)胞活化介導(dǎo)IGF-1對ANSCs增殖的影響，為內(nèi)源性ANSCs修復(fù)和細(xì)胞替代治療大腦缺血損傷疾病和神經(jīng)退行性疾病提供新的靶點(diǎn);也為支持和儲備系統(tǒng)新學(xué)說提供部分實驗依據(jù)。
　　 1、通過透射電子顯微鏡技術(shù)觀察新生大鼠缺血損傷早期對DG區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞

9、超微結(jié)構(gòu)影響;
　　 2、通過免疫組織化學(xué)方法檢測缺血損傷不同時間點(diǎn)對新生大鼠DG區(qū)和SVZ區(qū)神經(jīng)營養(yǎng)因子IGF-1表達(dá)的影響;
　　 3、通過免疫組織化學(xué)方法檢測缺血損傷不同時點(diǎn)對新生大鼠DG區(qū)和SVZ區(qū)ANSCs增殖的影響
　　 4、使用IGF-1阻斷劑(JB1)阻斷IGF-1的表達(dá)后，通過免疫組織化學(xué)方法檢測，缺血損傷對新生大鼠DG區(qū)和SVZ區(qū)IGF-1表達(dá)的影響
　　 5、使用JB1阻斷IGF-1

10、表達(dá)后，通過免疫組織化學(xué)方法檢測，缺血損傷對新生大鼠DG區(qū)和SVZ區(qū)ANSCs增殖變化的影響。
　　 方法：
　　 1、7日齡新生大鼠制作短暫腦缺血模型，分離皮下組織后，再分離頸總動脈和迷走神經(jīng)，使用動脈夾夾閉雙側(cè)頸總動脈10min，作為短暫腦缺血模型(BCCAO);假手術(shù)模型(SS)，分離皮下組織、頸總動脈和迷走神經(jīng)，不使用動脈夾夾閉雙側(cè)頸總動脈。
　　 2、7日齡新生大鼠70只隨機(jī)分為缺血組(BCCAO)(n

11、=27)、假手術(shù)組(SS)組(n=27)、缺血+阻斷劑組(BCCAO+JB1)(n=8)和缺血+生理鹽水組(BCCAO+SS)(n＝8)。短暫腦缺血后連續(xù)7d皮下注射IGF-1受體阻斷劑JB1作為BCCAO+JB1組，而短暫腦缺血后連續(xù)7d皮下注射等量體積的生理鹽水作為BCCAO+SS組。
　　 3、BCCAO組(n=3)和SS組(n=3)，在缺血后1d，利用透射電鏡技術(shù)觀察DG區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化。
　　 4、B

12、CCAO組(n＝24)和SS組(n＝24)，在缺血后1d、4d和7d利用免疫組織化學(xué)技術(shù)觀察DG區(qū)和SVZ區(qū)IGF-1的表達(dá)量和ANSCs的增殖變化情況(不同缺血時間點(diǎn)灌注前6h、4h和2h皮下注射BrdU標(biāo)記ANSCs的增殖)。
　　 5、BCCAO+JB1組(n＝8)和BCCAO+SS組(n＝8)，在缺血后連續(xù)7d皮下注射JB1，然后利用免疫組織化學(xué)技術(shù)觀察DG區(qū)和SVZ區(qū)IGF-1表達(dá)情況和ANSCs的增殖變化情況(灌注前

13、6h、4h和2h皮下注射BrdU標(biāo)記ANSCs的增殖)
　　 結(jié)果：
　　 1、利用透射電鏡技術(shù)觀察發(fā)現(xiàn)，在短暫缺血后早期即缺血后1d新生大鼠DG區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞從SS組靜息狀態(tài)的桿狀結(jié)構(gòu)變?yōu)锽CCAO組激活狀態(tài)的鋸齒狀結(jié)構(gòu)。
　　 2、利用免疫組織化學(xué)方法發(fā)現(xiàn)，與同時間點(diǎn)SS組比較，缺血后1d、4d、7d的DG區(qū)和SVZ區(qū)的新生細(xì)胞和IGF-1陽性細(xì)胞數(shù)目均顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)
　　

14、3、利用免疫組織化學(xué)方法發(fā)現(xiàn)，在缺血后連續(xù)7d皮下注射JB1，BCCAO+JB1組新生大鼠DG區(qū)和SVZ區(qū)IGF-1表達(dá)缺如，BCCAO+SS組新生大鼠DG區(qū)和SVZ區(qū)IGF-1表達(dá)正常。
　　 4、利用免疫組織化學(xué)方法發(fā)現(xiàn)，在缺血后連續(xù)7d皮下注射JB1，BCCAO+JB1組新生大鼠DG區(qū)和SVZ區(qū)的新生細(xì)胞顯著減少，與BCCAO+SS組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 新生大鼠缺血

15、再灌注損傷激活了免疫-神經(jīng)-內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)(immuno-neuro-endocrinenetwork，INEN)，最先激活的是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的先天免疫細(xì)胞即小膠質(zhì)細(xì)胞，尤其最早發(fā)生在對缺血敏感的海馬區(qū)域。本實驗發(fā)現(xiàn)在缺血早期即在缺血后1d小膠質(zhì)細(xì)胞大量聚集在神經(jīng)發(fā)生的特定區(qū)域DG區(qū)，其形態(tài)也從靜息狀態(tài)的桿狀結(jié)構(gòu)變?yōu)榧せ顮顟B(tài)的鋸齒狀結(jié)構(gòu)，其缺乏經(jīng)典M1小膠質(zhì)細(xì)胞表型的溶酶體結(jié)構(gòu)，表明在缺血早期小膠質(zhì)細(xì)胞就參與神經(jīng)發(fā)生，小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)改

16、變的基礎(chǔ)，正好解釋了促神經(jīng)發(fā)生即神經(jīng)保護(hù)這一小膠質(zhì)細(xì)胞功能表型;活化的小膠質(zhì)細(xì)胞通過自身表達(dá)或通過與星型膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元、血管內(nèi)皮細(xì)胞或外周的T細(xì)胞相互作用上調(diào)IGF-1表達(dá)，從而促使DG區(qū)和SVZ區(qū)的ANSCs增殖。當(dāng)使用IGF-1受體阻斷劑后，IGF-1表達(dá)被阻斷，DG區(qū)和SVZ區(qū)ANSCs增殖顯著減少，提示小膠質(zhì)細(xì)胞活化介導(dǎo)的IGF-1有利于大腦缺血損傷的修復(fù)。
　　 綜上所述，小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫-神經(jīng)-內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)與成體