高原高寒環(huán)境因素對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷作用及其保護(hù)作用化合物研究.pdf

1、研究背景：
　　我國(guó)高原面積廣大,且大多處于邊境地區(qū),戰(zhàn)略意義十分重要。高原特殊的地理環(huán)境和地貌特征造成了高原地區(qū)寒冷、低氧雙重脅迫的環(huán)境特點(diǎn)。高原環(huán)境不但損害人體健康,更影響高原部隊(duì)平戰(zhàn)時(shí)的機(jī)動(dòng)性和作訓(xùn)能力,因此解決高原官兵健康問(wèn)題是提高我軍戰(zhàn)斗力的必要環(huán)節(jié)。平原人初入高原時(shí),由于氧氣濃度驟減,機(jī)體發(fā)生了一系列的病理性變化,易患高原肺水腫、高原腦水腫,而久居高原的人由于長(zhǎng)期缺氧代償反應(yīng),易患肺動(dòng)脈高壓、高原性心臟病,而這些疾病的

2、始動(dòng)因子是內(nèi)皮細(xì)胞的紊亂。另外,在高原高寒的環(huán)境下,野外作業(yè)時(shí)間可能引起全身性低體溫(35～28℃),表現(xiàn)為外周血收縮、血液灌流減少、四肢易患凍傷,而此時(shí)最先受到損傷的仍是內(nèi)皮細(xì)胞。因此保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞,逆轉(zhuǎn)內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂成為防治高原疾病的新對(duì)策。納他卡林(natakalim,Nat)是可高選擇性的激活KATPSUR2B/Kir6.1亞型的先導(dǎo)化合物。前期研究已表明KATP的激活在高原肺水腫、高原腦水腫的防治上具有積極的作用,目前已知納他

3、卡林可以通過(guò)逆轉(zhuǎn)內(nèi)皮功能紊亂從而改善壓力超負(fù)荷致心力衰竭,而關(guān)于納他卡林對(duì)低氧所致的內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用與保護(hù)機(jī)制的研究還甚少。因此研究低溫、低氧及復(fù)合條件對(duì)機(jī)體的影響及其機(jī)制,并研究新型內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)藥物對(duì)抗低氧損傷的效果及其機(jī)理,具有重要的意義。
　　研究目的：
　　研究低溫(28℃)、低氧(3％O2)、低溫低氧復(fù)合三種條件下大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(rataorticendothelialcells,RAEC)的損傷規(guī)律,用

4、2×2析因分析的方法闡明復(fù)合損傷與單因素?fù)p傷的區(qū)別及復(fù)合條件下的主要影響因素,為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)高原高寒環(huán)境損傷提供理論依據(jù)。另外,針對(duì)ATP敏感性鉀通道SUR2B/Kir6.1亞型選擇性開(kāi)放劑——納他卡林,以急性低氧和高同型半胱氨酸(homocystein,HCY)作為損傷因素,研究藥物的內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用及其機(jī)制。
　　研究方法：
　　采用主動(dòng)脈血管片貼壁培養(yǎng)法,體外培養(yǎng)SPF級(jí)雄性Wistar大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞。用MTT法

5、測(cè)定細(xì)胞存活率、倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài),確定低溫?fù)p傷的有效作用時(shí)間。以21%O2、28℃培養(yǎng)30h為條件,研究低溫對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷作用;以3%O2、37℃培養(yǎng)30h為條件研究低氧對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷作用;在研究低溫低氧復(fù)合作用時(shí),將內(nèi)皮細(xì)胞分為正常對(duì)照組(21%O2、37℃)、低溫模型組(21%O2、28℃)、低氧模型組(3%O2、37℃)、復(fù)合模型組(3%O2、28℃),同時(shí)孵育內(nèi)皮細(xì)胞30h。用MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率、硝酸還原酶法檢測(cè)一

6、氧化氮(NO)的釋放、RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞間粘附因子-1(ICAM-1)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)、內(nèi)皮素-1(ET-1)基因的表達(dá)水平;Hoechst33258和TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡;WesternBlot法檢測(cè)HIF-1α蛋白表達(dá)水平;通過(guò)透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。用析因分析的方法,闡明復(fù)合損傷與單因素?fù)p傷的區(qū)別,確定復(fù)合條件下的低溫、低氧對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞影響的主次

7、效應(yīng)。
　　在研究納他卡林對(duì)低氧所致RAEC損傷的保護(hù)作用中,將細(xì)胞分為正常對(duì)照組、低氧模型組、納他卡林低、中、高劑量組,格列本脲拮抗組。用MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率、硝酸還原酶法檢測(cè)NO的釋放、黃嘌呤氧化酶法(羥胺法)測(cè)定SOD活力、RT-PCR法檢測(cè)ICAM-1、VEGF、ET-1的基因表達(dá)水平;ELISA法測(cè)定ICAM-1、VEGF蛋白的表達(dá)水平。在研究納他卡林對(duì)高HCY致RAEC損傷的保護(hù)作用中,用Realtime-PCR法檢

8、測(cè)血管細(xì)胞黏附因子(VCAM-1)、單核細(xì)胞趨化因子(MCP-1)和ICAM-1基因的表達(dá)水平。
　　研究結(jié)果：
　　1.血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定
　　采用主動(dòng)脈血管片貼壁的方法,培養(yǎng)出大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞,經(jīng)CD31免疫熒光鑒定,內(nèi)皮細(xì)胞陽(yáng)性率98%以上。
　　2.寒冷對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響
　　根據(jù)細(xì)胞存活率的測(cè)定和形態(tài)學(xué)的觀察,確定30h為低溫?fù)p傷的有效作用時(shí)間,因此將28℃孵育細(xì)胞30h作為研究低體溫?fù)p

9、傷的體外模型。研究發(fā)現(xiàn)低溫具有明顯的降低細(xì)胞增殖率,抑制細(xì)胞NO釋放的作用,此外,低溫在細(xì)胞凋亡和通透性方面具有一定的抑制作用,而在炎性因子的釋放、內(nèi)皮素基因表達(dá)方面有一定的促進(jìn)作用,低溫時(shí)可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生擴(kuò)張,呈大泡狀。
　　3.高原低氧對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的影響
　　低氧可促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制NO釋放,增強(qiáng)炎性因子和內(nèi)皮素基因表達(dá),可導(dǎo)致血管通透性增高,HIF-1α表達(dá)量增多,低氧時(shí)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變表現(xiàn)為線(xiàn)粒體腫脹、斷裂,質(zhì)膜小

10、泡增多。
　　4.低溫低氧復(fù)合因素對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的影響
　　低溫低氧復(fù)合因素在細(xì)胞存活率、內(nèi)皮活性因子的釋放(NO、ET-1)、炎性因子表達(dá)、HIF-1α蛋白表達(dá)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞器變化方面存在著交互作用,在通透性方面沒(méi)有交互作用。具體表現(xiàn)為:當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞長(zhǎng)至60%后進(jìn)行干預(yù),復(fù)合組細(xì)胞存活率與對(duì)照組、低溫組、低氧組相比均有所下降,低溫低氧對(duì)細(xì)胞存活率的影響具有正交互效應(yīng),在復(fù)合條件下低溫為主要因素,對(duì)細(xì)胞存活率的影響更為顯著。當(dāng)內(nèi)

11、皮細(xì)胞長(zhǎng)至100%后進(jìn)行干預(yù),復(fù)合組的細(xì)胞存活率與對(duì)照組、低溫組相比有所降低,但與低氧組相比略有升高,低溫低氧對(duì)細(xì)胞存活率的影響無(wú)交互效應(yīng),在復(fù)合條件下僅低氧對(duì)細(xì)胞存活率的具有顯著性影響。在NO釋放方面,復(fù)合組的細(xì)胞NO的釋放量與對(duì)照組、低溫組、低氧組相比均有大幅下降,低溫低氧對(duì)細(xì)胞NO的釋放量的影響具有正交互效應(yīng),在復(fù)合條件下低溫為主要因素,對(duì)細(xì)胞NO釋放量的影響更為顯著。在細(xì)胞凋亡方面,低氧和復(fù)合條件下,均有細(xì)胞凋亡現(xiàn)象,且復(fù)合組比

12、低氧組凋亡細(xì)胞少;提示在復(fù)合條件下,低溫低氧具有負(fù)交互效應(yīng),低氧為主要影響因素,低溫對(duì)細(xì)胞凋亡具有一定的保護(hù)作用。在炎性因子表達(dá)方面,復(fù)合組的細(xì)胞ICAM-1mRNA的表達(dá)量與對(duì)照組、低溫組相比均有所升高,但比低氧組的表達(dá)量低,低溫低氧對(duì)細(xì)胞ICAM-1基因表達(dá)的影響具有負(fù)交互效應(yīng),在復(fù)合條件下低氧為主要因素,對(duì)細(xì)胞炎性因子表達(dá)的影響更為顯著。在細(xì)胞通透性方面,復(fù)合組的細(xì)胞VEGFmRNA的表達(dá)量與對(duì)照組、低溫組相比顯著性升高,比低氧組

13、的表達(dá)量顯著降低,低溫低氧對(duì)細(xì)胞VEGF基因表達(dá)的影響無(wú)顯著性交互效應(yīng),在復(fù)合條件下低氧為主要因素,對(duì)細(xì)胞VEGF基因表達(dá)具有極顯著的影響。在ET-1基因表達(dá)方面,復(fù)合組的細(xì)胞ET-1mRNA的表達(dá)量與對(duì)照組、低溫組相比均有所升高,但比低氧組的表達(dá)量低,低溫低氧對(duì)細(xì)胞ET-1基因表達(dá)的影響具有負(fù)交互效應(yīng),在復(fù)合條件下低氧為主要因素,對(duì)細(xì)胞ET-1基因表達(dá)的影響更為顯著。在低氧誘導(dǎo)因子(HIF-1α)的表達(dá)方面,復(fù)合組細(xì)胞HIF-1α蛋白

14、表達(dá)量與對(duì)照組、低溫組相比極顯著性升高,與低氧組相比略有降低,低溫低氧對(duì)細(xì)胞HIF-1α蛋白的表達(dá)量的影響具有負(fù)交互效應(yīng),在復(fù)合條件下低氧為主要因素,對(duì)細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá)的影響更為顯著。在細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)方面,低溫低氧復(fù)合條件出現(xiàn)了線(xiàn)粒體發(fā)腫脹、斷裂,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張等超微結(jié)構(gòu)的損傷,與單因素?fù)p傷相比具有一定的加成作用。
　　總之在復(fù)合損傷中,低溫在細(xì)胞增殖力和NO釋放量方面為主要影響因素,與低氧復(fù)合具有正交互作用。低氧在細(xì)胞凋亡、炎

15、性因子的釋放、通透性改變、HIF-1α的表達(dá)方面為主要影響因素,低溫低氧復(fù)合時(shí)具有拮抗作用,即低溫具有一定的低氧損傷保護(hù)作用。
　　5.納他卡林對(duì)低氧致內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用
　　氧氣濃度為3%的條件下培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞24h,與對(duì)照組相比細(xì)胞存活率降低了22.3%,NO釋放量下降了39.9%,SOD活力降低了61.8%,ICAM-1、ET-1、VEGF基因表達(dá)量均顯著上調(diào)(P<0.05,P<0.01);低氧干預(yù)12h后ICAM-

16、1、VEGF蛋白表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05,P<0.01)。0.1、1、10μmol/L納他卡林與內(nèi)皮細(xì)胞孵育8h,在氧氣濃度為3%的條件下培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞24h后,與模型組相比,納他卡林三個(gè)劑量組均可逆轉(zhuǎn)低氧所致的血管內(nèi)皮細(xì)胞功能改變,包括提高內(nèi)皮細(xì)胞生存活力和NO的釋放水平、增強(qiáng)SOD活力、顯著抑制低氧所致ICAM-1、ET-1、VEGF基因過(guò)度表達(dá)(P<0.05,P<0.01)及ICAM-1、VEGF蛋白的高表達(dá)(P<0.05,P<

17、0.01)。使用格列本脲作為拮抗劑預(yù)孵育內(nèi)皮細(xì)胞6h,再用10μmol/L納他卡林孵育8h后,置于氧濃度為3%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,在細(xì)胞存活率、NO的釋放和SOD活性方面,格列本脲可顯著逆轉(zhuǎn)納他卡林的保護(hù)作用(P<0.01)。
　　6.納他卡林對(duì)高同型半胱氨酸致內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用
　　0.1mmol/L同型半胱氨酸孵育大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞6h,與正常對(duì)照組相比,VCAM-1、ICAM-1、MCP-1基因表達(dá)水平均顯著上

18、調(diào)。0.001,0.01,0.1,1,10μmol/L納他卡林與內(nèi)皮細(xì)胞共孵育8h,再給予0.1mmol/LHCY孵育6h后,與模型組相比,0.001～10μmol/L納他卡林均可顯著抑制高同型半胱氨酸所致VCAM-1、ICAM-1、MCP-1基因過(guò)度表達(dá),但未呈現(xiàn)明顯的劑量依賴(lài)效應(yīng),0.001μmol/L納他卡林即可對(duì)高同型半胱氨酸致內(nèi)皮細(xì)胞炎性因子的過(guò)度表達(dá)起到抑制作用,說(shuō)明納他卡林具有強(qiáng)效的內(nèi)皮保護(hù)效果。
　　結(jié)論：

19、　　低溫低氧復(fù)合損傷與單因素?fù)p傷不同,在細(xì)胞增殖、NO釋放、炎癥因子表達(dá)、內(nèi)皮素基因表達(dá)、細(xì)胞凋亡、HIF-1α蛋白表達(dá)方面具有交互效應(yīng),在VEGF基因方面無(wú)交互作用。低溫低氧復(fù)合在抑制細(xì)胞增殖、抑制NO的釋放方面具有正交互效應(yīng),而在炎性因子表達(dá)、ET-1基因表達(dá)、細(xì)胞凋亡、HIF-1α蛋白表達(dá)方面,具有負(fù)交互效應(yīng),即低溫對(duì)低氧損傷起到了一定的保護(hù)作用。以KATP為靶點(diǎn)的先導(dǎo)化合物納他卡林可逆轉(zhuǎn)低氧及高同型半胱氨酸誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂