白背飛虱10個轉(zhuǎn)氨酶基因的克隆與2個丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶的功能驗證.pdf

1、轉(zhuǎn)氨酶(Transaminase)是一種催化轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)的轉(zhuǎn)移酶，將氨基酸的α-氨基轉(zhuǎn)移到一種α-酮酸上。白背飛虱長期取食氨基酸營養(yǎng)不平衡的植物韌皮部汁液卻仍能正常發(fā)育，有研究表明可能是其體內(nèi)共生菌為其提供必需氨基酸，從而保證了飛虱的營養(yǎng)平衡。轉(zhuǎn)氨酶在氨基酸的代謝過程中起到重要的作用，也是昆蟲生長發(fā)育過程中重要的酶類。
　　本文搜索了重要的水稻害蟲——白背飛虱的轉(zhuǎn)錄組中氨基酸代謝相關(guān)的轉(zhuǎn)氨酶基因，采用RT-PCR、RACE技術(shù)獲得了

2、轉(zhuǎn)氨酶基因的cDNA全長;利用Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)進行轉(zhuǎn)氨酶基因的蛋白體外表達，通過測定轉(zhuǎn)氨酶的活性來驗證轉(zhuǎn)氨酶基因的功能。研究結(jié)果總結(jié)如下:
　　1.白背飛虱轉(zhuǎn)氨酶基因的克隆及密碼子偏性分析
　　基于白背飛虱轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫和RT-PCR技術(shù)，得到了編碼9類轉(zhuǎn)氨酶的20條片段序列，5類轉(zhuǎn)氨酶共7個基因來自共生菌，而其余4類轉(zhuǎn)氨酶中8個基因來自宿主昆蟲，5個來自共生菌。應(yīng)用RACE技術(shù)獲得了2條丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、3條

3、犬尿氨酸α-酮戊二酸轉(zhuǎn)氨酶、2條天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、1條支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶、1條乙酰鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶和1條丙氨酸-乙醛酸氨基轉(zhuǎn)移酶的cDNA全長。序列比對、系統(tǒng)進化樹和密碼子偏好性分析結(jié)果進行分析，推測支鏈氨基酸(Val、Leu、Ile)、精氨酸(Arg)、絲氨酸(Ser)、芳香族氨基酸（Tyr、Phe、Trp)的合成和分解過程中轉(zhuǎn)氨基作用由共生菌完成的，而丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸和甘氨酸的代謝過程中轉(zhuǎn)氨基作用由宿主昆蟲和共生菌協(xié)同完成。

4、　　2.白背飛虱丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶和支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶基因的序列分析及時空表達
　　序列比對發(fā)現(xiàn)，上章獲得的兩條ALTs均具有轉(zhuǎn)氨酶第Ⅰ亞家族的保守功能域，并含有保守的5'-磷酸吡哆醛結(jié)合位點;同時，SfylsALT在白背飛虱各個發(fā)育時期均表達，并且在5齡若蟲期出現(xiàn)表達高峰，在2齡若蟲期表達量最低，其他時期的表達量比較一致;相反，SfALT1在性成熟的雄蟲中表達量最高，其次是4齡若蟲和1齡若蟲，而在其他時期體內(nèi)的表達量較低。SfylsAL

5、T在白背飛虱腹部高表達，而SfALT1在頭、胸、腹、翅、足各部分廣泛表達。而SfylsBCAT1具有轉(zhuǎn)氨酶第Ⅲ亞家族的保守功能域，并且多肽結(jié)合位點、底物輔酶結(jié)合位點和活性位點的氨基酸殘基都保守。SfylsB CA T1在5齡若蟲期表達量最高，2齡若蟲期表達量最低，其他齡期的表達比較一致。
　　3.白背飛虱丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶和支鏈氨基酸的真核表達及丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶酶活性測定
　　為驗證白背飛虱轉(zhuǎn)氨酶基因的功能，分別構(gòu)建2個丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶基