水稻PHR1家族高親和順式作用元件HA-P1BS的發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用研究.pdf

1、磷(Phosphate，P)是植物生長所需大量必需元素之一;磷營養(yǎng)在植物生長發(fā)育中發(fā)揮著重要作用，對農(nóng)作物的豐產(chǎn)不可或缺。在植物磷信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，PHR1(Phosphate Starvation Response1)作為網(wǎng)絡(luò)中心調(diào)控因子，調(diào)控植物磷信號與磷平衡。PHR1結(jié)合的順式作用元件（cis-element）(PHR1-binding sequence:P1BS)已被揭示，本研究旨在研究P1BS對水稻中PHR1的同源基因OsPHR

2、2的親和力的影響，探索利用高親和順式作用元件對作物進行磷吸收作用的遺傳改良。
　　利用酵母單雜(Yeast-one-hybridization)和凝膠阻滯分析（Electrophoreticmobility shift assay，EMSA）技術(shù)，發(fā)現(xiàn)OsPHR2對不同下游調(diào)控基因OsIPS1、OsIPS2、OsPT和OsPHF1的親和力存在顯著差異，其中對OsIPS2的P1BS親和力最高，而對OsPT2的親和力最低。
　　

3、通過進一步研究發(fā)現(xiàn)，有兩個因素影響著OsPHR2對P1BS的親和力:一是P1BS旁側(cè)P1BS-like序列，二是P1BS的可變堿基。當(dāng)僅有P1BS序列存在時，OsPHR2不能有效識別P1BS;只有當(dāng)P1BS與P1BS-like同時存在時，OsPHR2才能與P1BS有效結(jié)合。通過對OsIPS2的P1BS1可變堿基的逐一替換發(fā)現(xiàn)，當(dāng)?shù)谝粋€可變堿基‘A’替換為‘T'、‘C’或‘G’時，OsPHR2對P1BS1的親和力都顯著下降;當(dāng)?shù)诙€可變堿

4、基‘G’替換為‘A’或‘C’時，OsPHR2對P1BS1的親和力并沒有發(fā)生顯著改變，而當(dāng)‘G’替換為‘T’時，OsPHR2對P1BS1的親和力顯著增加。由此說明P1BS第一個可變堿基是‘A’時較有利于OsPHR2的結(jié)合，并且當(dāng)?shù)谝粋€和第二個可變堿基是‘A-T’組合(A-T-type)時最有利于OsPHR2與P1BS的穩(wěn)定結(jié)合。在P1BS1為A-T-type的條件下，對P1BS-like進行趨向于A-T-type-P1BS的替換，結(jié)果發(fā)現(xiàn)

5、P1BS-like變?yōu)锳-T-type-P1BS時能進一步提高OsPHR2的親和力。由此本研究獲得了一個OsPHR2高親和的P1BS-P1BS-like組合元件:A-T-type-P1BS-A-T-type-P1BS，即HA-P1BS。
　　隨后，本研究利用HA-P1BS對OsPHF1（Phosphate Transporter TrafficFacilitator1）啟動子進行了改造。酵母單雜和EMSA技術(shù)分析結(jié)果表明，OsPH

6、R2對HA-P1BS改造后的OsPHF1啟動子親和力顯著提高了。利用OsPHF1啟動子和HA-P1BS改造啟動子融合GUS的轉(zhuǎn)基因材料進一步證明HA-P1BS能提高OsPHF1表達(dá)水平。通過GUS組織切片分析發(fā)現(xiàn)，由HA-P1BS啟動的OsPHF1組織表達(dá)沒有發(fā)生變化。因此，本研究發(fā)展了P OsPHF1-HA-P1BS: PHF1(CDS)的轉(zhuǎn)基因材料(即:PHF1-HA-P1BS)，用于分析HA-P1BS改造后的OsPHF1能否提高植

7、株的磷吸收效率。溶液培養(yǎng)結(jié)果表明，在200μM和10μM Pi條件下，兩個獨立轉(zhuǎn)基因株系在葉片中的有效磷都要顯著高于野生型，但并不影響植株正常生長。33p吸收動力學(xué)實驗進一步證實PHF1-HA-P1BS的磷吸收能力要顯著高于野生型。通過在高磷和低磷條件下的盆栽實驗發(fā)現(xiàn)，PHF1-HA-P1BS表現(xiàn)出了耐低磷的特性:轉(zhuǎn)基因材料單株產(chǎn)量以及種子與植株總磷含量顯著增加。
　　綜上所述，本研究揭示了順式作用元件P1BS可變堿基和P1BS-