水稻Pht1家族磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因的時空表達特征研究.pdf

1、磷是植物生長發(fā)育必需的大量營養(yǎng)元素之一，盡管在土壤中含量很高，但是它在土壤中的有效性卻非常低，使其成為植物生長的一個限制性因子。植物需要通過表達多種不同親和的磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白來吸收和轉(zhuǎn)運土壤中的有效磷。水稻種植面積廣，全世界有一半的人口都以稻米為食.盡管水稻中屬于Pht1家族的全部13個磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因的序列已經(jīng)被揭示，但是對它們的研究有限，除了明確其中的兩個基因，OsPhtl；11(OsPT11)和OsPhtl；13(OsPT13分別

2、受菌根強烈誘導(dǎo)和增強表達，其他Phtl基因的表達特征和功能還不了解。鑒于在過去發(fā)表的文章中已經(jīng)將該家族的磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白簡單定義為OsPT，為了便于比較和簡單化，本文中所有Phtl家族全部13個轉(zhuǎn)運蛋白仍然采用OsPTs命名，按序列編號.為了研究OsPTs基因家族的時空表達模式和對磷素的響應(yīng)機制，本研究構(gòu)建了從模式品種日本晴(Oryza Sativa ssp. JapoIuca cv. Nipponbare)中12個Phtl基因的各個自身

3、的啟動子與GUS報告基因和GFP報告基因相連接的基因，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化到水稻(日本晴).通過分析這些轉(zhuǎn)基因水稻在缺磷和正常供磷情況下GUS(β-Glucuronidase)和GFP(Green Fluorescent Protein)報告基因的表達確定OsPhtls家族各個基因的時空表達特征。通過與啟動子區(qū)域中順式作用元件和不同植物中Phtl家族基因的同源性和表達特征的異同分析，進一步分析推測了水稻中各個Phtl家族轉(zhuǎn)運蛋白在磷素吸

4、收和轉(zhuǎn)運方面的功能。所獲主要結(jié)果如下： 1.通過軟件WOLFPSORT(http://wolfpsort.org/)分析亞細胞定位，發(fā)現(xiàn)OsPTs基因家族的所有基因都定位于細胞膜上.分析36個來自不同植物的Phtl家族基因的系統(tǒng)進化樹表明，13個OsPTs基因進化關(guān)系非常接近，并且可以具體分為3個功能組.基因比對發(fā)現(xiàn)，13個OsPTs基因分別分布在水稻12條染色體中的第1，3，4，6，8和10號染色體上，啟動子序列分析發(fā)現(xiàn)，W-

5、box，PHO-like element和PIBS三個可能參與缺磷誘導(dǎo)表達基因的啟動子中的基序在水稻13個OsPTs基因家族中分別有出現(xiàn)，而且在不同基因啟動子中還有多個拷貝. 2.RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，在營養(yǎng)液栽培的缺磷處理條件下，OsPT1，OsPT2，OsPT3，OsPT4，OsPT5，OsPT6，OsPT7，OsPT8和OsPT12在根部都檢測到了基因表達，其中OsPT2，OsPT3，OsPT6和OsPT7缺磷條件下在根部

6、增強表達；OsPT1，OsPT2，OsPT3，OsPT5，OsPT6，OsPT7，OsPT8和OsPT12在葉片中有基因表達，其中OsPT1，OsPT3，OsPT6，OsPT7和OsPT12缺磷條件下在葉片中增強表達。在我們的研究條件下，OsPT9，OsPT10，OsPT11和OsPT13沒有檢測到基因表達信號。 3.通過分析其內(nèi)源啟動子與GUS/GFP報告基因連接的轉(zhuǎn)基因水稻植株中GUS/GFP的時空表達狀況，按照GUS/GF

7、P的表達的部位和強度與活性確定相應(yīng)基因水稻中的表達特征，發(fā)現(xiàn)OsPT1在缺磷條件下，根尖、支根發(fā)生區(qū)、根莖結(jié)合部、葉片均有強烈表達；在正常供磷情況下，OsPT1的表達略有減弱，但表達部位沒有發(fā)生明顯改變。在OsPT1花藥、灌漿期種子和發(fā)芽種子中都檢測到了該基因的表達。OsPT2基因受缺磷強烈誘導(dǎo)表達，在缺磷三周后，水稻的根尖、支根發(fā)生區(qū)和根莖結(jié)合部都有OsPT2的強烈表達，且集中在根尖、支根發(fā)生區(qū)和根莖結(jié)合部的中柱部位，但在表皮和皮層細

8、胞沒有表達。在灌漿期種子和發(fā)芽種子中也有OsPT2的表達。OsPT3在缺磷條件下，根尖、支根發(fā)生區(qū)都有基因表達，而且在根部缺磷條件下基因表達比供磷條件有明顯增強。在灌漿期種子和發(fā)芽種子中也有OsPT3基因的表達。OsPT4在缺磷和供磷條件下根尖和支根發(fā)生區(qū)都有微弱的表達。但OsPT4在葉片、灌漿期種子和發(fā)芽種子沒有表達。OsPT5在缺磷三周后，根尖、支根發(fā)生區(qū)、根莖結(jié)合部和葉片均有很微弱的表達，但是在供磷條件下其表達消失；在花藥、灌漿期

9、種子和發(fā)芽種子均沒有OsPT5基因的表達。OsPT6是受缺磷強烈特異誘導(dǎo)表達的基因，缺磷三周后，在根尖、支根發(fā)生區(qū)、根莖結(jié)合部、葉片、花藥的中線部和發(fā)芽種子中都檢測到OsPT6基因的強烈表達。在灌漿期種子沒有檢測到OsPT6基因表達。OsPT7在缺磷處理下，支根發(fā)生區(qū)和葉片表達強烈，但根尖沒有檢測到該基因的表達，而在供磷條件下，基本檢測不到OsPT7基因在葉片中的表達。在花藥中檢測到了OsPT7的表達。OsPT8無論在缺磷或者供磷條件下

10、，除了根冠外的根系和葉片各部位都能檢測到強烈的表達，用其啟動子與GFP連接基因的轉(zhuǎn)水稻植株中的GFP表達分析同樣重復(fù)了GUS報告基因表達的結(jié)果。與RT-PCR分析結(jié)果一致，OsPT9、OsPT10，OsPT11和OsPT13四個基因在本溶液栽培試驗研究條件下，缺磷和正常供磷處理三周后的水稻植株中均沒有檢測到它們的表達. 4.根據(jù)順勢作用元件(cis-elements)分析結(jié)果，結(jié)合RT-PCR和轉(zhuǎn)基因水稻檢測結(jié)果，推測W-box

11、和P1BS兩個基序協(xié)同調(diào)控水稻缺磷條件下的基因表達，而PHO-like element可能對磷信號途徑中磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白表達調(diào)控作用有限。 5.推測OsPT1，OsPT2，OsPT3，OsPT5，OsPT6和OsPT7六個磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白在水稻缺磷條件下對磷素的吸收有重要作用；OsPT1，OsPT2，OsPT6，OsPT7和OsPT8五個磷酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白與水稻缺磷奈件下磷素的再轉(zhuǎn)運有關(guān)；OsPT1，OsPT2，OsPT3，OsPT4，