中國荷斯坦公牛SPEF2基因表達(dá)與精液品質(zhì)的相關(guān)性分析.pdf

1、隨著牛人工授精技術(shù)的廣泛推廣，種公牛對(duì)奶牛群體遺傳進(jìn)展貢獻(xiàn)達(dá)70％以上，使得高質(zhì)量的精液品質(zhì)與經(jīng)濟(jì)效益直接相關(guān)。正常的精子鞭毛對(duì)于精子運(yùn)動(dòng)和受精能力必不可少，它涉及到多個(gè)具有細(xì)胞時(shí)空特異性的基因協(xié)同表達(dá)。因此，鑒定新生公牛與成年公牛睪丸中特異表達(dá)的基因及其分子調(diào)控機(jī)理對(duì)于闡明睪丸發(fā)育及精子發(fā)生的機(jī)理至關(guān)重要。已有研究表明，SPEF2（Sperm flagella2）基因與精子鞭毛的正常發(fā)育和男性生殖力密切相關(guān)。本試驗(yàn)通過研究SPEF2基

2、因在中國荷斯坦公牛睪丸、附睪和精子中表達(dá)，功能性SNPs的鑒定及啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平分析，以增加對(duì)SPEF2基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理及其與公牛精液品質(zhì)的關(guān)系的了解，豐富對(duì)公牛高繁殖性狀形成的分子機(jī)理的認(rèn)識(shí)。
　　一、中國荷斯坦公牛SPEF2基因可變剪接體鑒定
　　利用RT-PCR、克隆測(cè)序在公牛睪丸組織中檢測(cè)到4種新的SPEF2可變剪接體，分別命名為SPEF2-SV1、SPEF2-SV、SPEF2-SV3和SPEF2-SV4。West

3、ern blot技術(shù)檢測(cè)到SPEF2蛋白在新生公牛和成年公牛心、肝、脾、肺、腎和睪丸組織的表達(dá)。IHC揭示了SPEF2蛋白在睪丸的初級(jí)精母細(xì)胞、伸長的精子和圓形精子中表達(dá)。SPEF2參考轉(zhuǎn)錄本在成年公牛高精液品質(zhì)組和低精液品質(zhì)組中存在差異表達(dá);SPEF2-SV1在除新生公牛肺組織外的其他組織及成年公牛各組織中均有表達(dá)，;SPEF2-SV2主要在成年公牛睪九和附睪中表達(dá);SPEF2-SV3僅在成年公牛睪丸和附睪中表達(dá);SPEF2-SV4表

4、達(dá)量很低，各組織中（心、肝、脾、肺、腎、附睪和睪丸）未檢測(cè)到。因此推測(cè)，SPEF2基因表達(dá)的不同轉(zhuǎn)錄本參與精子發(fā)生過程相關(guān)。
　　二、與可變剪接體相關(guān)的功能性SNP（single nucleotide polymorphism）鑒定
　　通過直接測(cè)序技術(shù)篩選到2個(gè)位于潛在外顯子剪切增強(qiáng)子內(nèi)的功能性單核苷酸突變位點(diǎn)(SNPs)，c.2851G＞T和g.11043C＞T。經(jīng)ESEfinder3.0軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，突變位點(diǎn)c.285

5、1G＞T（位于外顯子20內(nèi)）增加SRp40剪切因子與靶序列的結(jié)合位點(diǎn)，可能導(dǎo)致SPEF2-SV3剪切體的產(chǎn)生，并且與精子畸形率和精子解凍后活力顯著相關(guān)（P＜0.05）。位于第一內(nèi)含子內(nèi)的突變位點(diǎn)g.11043C＞T改變了剪切因子結(jié)合蛋白SC35與靶序列的結(jié)合位點(diǎn)，它可能是產(chǎn)生異常轉(zhuǎn)錄本（SPEF2-SV4）的重要原因，此SNP與精子畸形率顯著相關(guān)（P＜0.05）。兩個(gè)突變位點(diǎn)可作為荷斯坦公牛精液品質(zhì)選擇的潛在功能性分子標(biāo)記。
　　

6、三、中國荷斯坦公牛SPEF2基因5'側(cè)翼區(qū)核心啟動(dòng)子鑒定及啟動(dòng)子區(qū)甲基化分析
　　通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，在SPEF2基因5'側(cè)翼區(qū)預(yù)測(cè)到一個(gè)啟動(dòng)子及一個(gè)CpG島。構(gòu)建7個(gè)缺失片段pGL3重組質(zhì)粒，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染MLTC-1細(xì)胞，確定了5'側(cè)翼區(qū)核心啟動(dòng)子位置位于g.-586～g.-157，而預(yù)測(cè)到的CpG島(g.-430～g.-161)正好位于核心啟動(dòng)子區(qū)。通過巢式BSP方法獲得了該CpG島序列(271bp)，利用克隆測(cè)序方法分析了SPE