C3基因多態(tài)性及其與中國荷斯坦牛生產(chǎn)性狀的相關(guān)性分析.pdf

1、疾病是影響家畜生產(chǎn)的主要因素，在發(fā)達國家，由疾病造成的損失占家畜生產(chǎn)總成本的17％左右，而在發(fā)展中國家，損失則高達35～50％。多種病原菌感染引發(fā)的奶牛乳腺炎，是奶牛常見的多發(fā)性疾病，給世界各國奶牛業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失。目前已有多種方法來防控奶牛乳腺炎，雖然也取得了一定的臨床效果，但卻引發(fā)了耐藥菌株和抗生素殘留等公共衛(wèi)生問題。因而，應(yīng)用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)分析抗性和易感群體中候選基因的標(biāo)記等位基因頻率差異，結(jié)合遺傳育種技術(shù)，從根本上提高家畜

2、的抗病性與健康水平已成為當(dāng)今家畜抗病育種研究的熱點。
　　補體(Complement)作為存在于人或脊索動物血清和組織液中的一組不耐熱的經(jīng)過活化后具有酶活性的球蛋白，其作用主要表現(xiàn)在溶解細(xì)菌和病毒、殺傷腫瘤細(xì)胞及感染病毒的細(xì)胞、免疫粘附和調(diào)理吞噬以及作為炎癥介質(zhì)上。補體成分3(C3)位于補體經(jīng)典途徑、甘露糖結(jié)合凝集素途徑和補體旁路途徑三條激活途徑的匯合點，是補體系統(tǒng)最重要的分子；而且C3裂解片段及其結(jié)合蛋白復(fù)雜多樣，不僅可以通過自

3、身的激活、裂解，參與補體的級聯(lián)反應(yīng)，還可以與各種相關(guān)因子發(fā)生相互作用，完成對病原菌的免疫粘附和吞噬作用，對補體系統(tǒng)進行調(diào)節(jié)。因而，C3在免疫防御、免疫調(diào)控以及免疫病理中發(fā)揮著重要的作用。當(dāng)C3基因發(fā)生突變或缺失時會造成C3缺陷性疾病，常伴發(fā)免疫性疾病及反復(fù)細(xì)菌感染，患者對病原菌感染的易感性顯著增加。運用蛋白電泳分型技術(shù)和PCR限制性酶切片段多態(tài)性(PCR-RFLP)、PCR單鏈構(gòu)象多態(tài)性(PCR-SSCP)及DNA測序技術(shù)分析人、豬、小

4、鼠及羊等哺乳動物中的C3基因，發(fā)現(xiàn)其存在多態(tài)性，眾多研究表明C3多態(tài)性與某些補體缺失性疾病、炎癥反應(yīng)及精神性障礙疾病均有著重要的關(guān)聯(lián)性。
　　中國荷斯坦奶牛是由引進的純種Holstein公牛與本地母牛的高代雜交種，經(jīng)長期選育而成，產(chǎn)奶量較高，但乳腺炎發(fā)病率也高達38％～50％。而魯西黃牛和渤海黑牛是山東省特有的、最具代表性的中國肉牛八大品種之一，耐粗飼、乳腺炎發(fā)病率較低。本試驗試圖比較三個牛群中C3基因單核苷酸多態(tài)性(SNP)差異

5、，分析其與中國荷斯坦奶牛產(chǎn)奶性狀的關(guān)聯(lián)性，進而通過血清中C3濃度測定、補體活性測定、抗菌試驗等一系列試驗，驗證相關(guān)性分析結(jié)果，初步闡明其抗性機理。
　　本文掃描了中國荷斯坦牛、魯西黃牛、渤海黑牛的C3基因前33個外顯子區(qū)及5’側(cè)翼區(qū)片段，發(fā)現(xiàn)了3個新的SNP位點，進一步分析了此三個位點在三個中國牛群中的多態(tài)性及其與中國荷斯坦奶牛產(chǎn)奶性狀的相關(guān)性，在此基礎(chǔ)上，進一步研究了其與354頭中國荷斯坦奶牛的補體活性(CH50，ACH50)、

6、C3濃度關(guān)聯(lián)性，并通過對乳牛乳腺炎主要致病菌金葡菌和大腸桿菌的抑菌實驗來驗證我們的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果。相關(guān)實驗結(jié)果如下:
　　采用巢式PCR和DNA測序方法，發(fā)現(xiàn)了三個新的SNP位點(g。-1293C>G，g。56T>C，g。7017C>T)，已經(jīng)提交至 NCBI數(shù)據(jù)庫中，SNPs登錄號分別為ss289377982，ss289377985，ss289377986。SNP(g。-1293C>G)位于5’側(cè)翼區(qū)，推測該區(qū)域及鄰近區(qū)域可能對

7、C3蛋白的表達調(diào)控和信號肽的表達起決定性的作用；SNP(g。56T>C)位于外顯子1上，導(dǎo)致編碼信號肽的第19個氨基酸從甲硫氨酸突變成蘇氨酸；SNPs(g。7017C>T)位于外顯子12上，為無義突變，CAC(His)>CAT(His)，仍編碼C3蛋白beta鏈的第455位的組氨酸。
　　通過CRS-PCR和PCR-RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism-PCR)方法，發(fā)現(xiàn)3個S

8、NP位點(g。-1293C>G，g。56T>C，g。7017C>T)在中國荷斯坦牛、魯西黃牛、渤海黑牛群體的優(yōu)勢等位基因相同，均為:C，T，C；其頻率分別是83.5％/88。21％/76％，70.62％/85.75％/82％，82.89％/80.19％/80％。經(jīng)χ2適合性檢驗，除 g。-1293C>G位點在魯西黃牛中沒有達到 Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P＜0.05)外，三個位點g。-1293C>G，g。56T>C，g。70

9、17C>T在三個牛群中均達到Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P＞0.05)。中國荷斯坦牛和魯西黃牛在g。-1293C>G位點，魯西黃牛在g。56T>C位點、中國荷斯坦牛在g。7017C>T位點都表現(xiàn)為低度多態(tài)(PIC<0.25)；其余則均表現(xiàn)為中度多態(tài)(0.25　　對具有3個泌乳記錄的821頭中國荷斯坦牛C3基因與體細(xì)胞數(shù)和產(chǎn)奶性狀進行了相關(guān)性分析，在試驗群體中三個位點共構(gòu)建出8種單倍型，發(fā)現(xiàn)19種單倍

10、型組合。關(guān)聯(lián)性分析發(fā)現(xiàn)g。-1293C>G與乳蛋白含量存在顯著相關(guān)性(P＜0.05)，而位點g。56T>C與SCS具顯著相關(guān)性(P＜0.05)。在單倍型組合中，H1H1(CCC/CCC)的奶牛個體其乳脂率和乳蛋白率顯著要高于H1H8(CCC/GTT)的奶牛個體(P＜0.05)，而 H1H5(CCC/GCC)個體的SCS顯著低于H1H8(CCC/GTT)個體(P＜0.01)。以奶牛乳腺炎主要致病菌金黃色葡萄球菌和大腸桿菌作為試驗對象，選擇

11、單倍型組合為H1H5的個體作為乳腺炎抗性個體組，選擇單倍型組合為H1H8的個體作為易感個體組，體外抑菌試驗表明:易感組和抗性處理組的菌落數(shù)都顯著高于未處理的抗性組個體(P＜0.01)；也進一步證實對乳腺炎的抗性與血清中的C3蛋白相關(guān)。因而，單倍型組合H1H1(CCC/CCC)和H1H5(CCC/GCC)可作為未來選擇抗乳腺炎和高乳蛋白奶牛的分子標(biāo)記。
　　首次大規(guī)模測定了有足夠血清的354頭中國荷斯坦奶牛的血清中C3蛋白濃度和補體

12、溶血活性，奶牛血清中C3濃度范圍是1.1-48。9mg/mL；CH50范圍是8.02-204.36 U/mL； ACH50范圍是11.67-95。12 U/mL。分析了C3基因單個SNPs位點及其單倍型組合與血清中C3蛋白濃度和補體溶血活性的相關(guān)性。發(fā)現(xiàn):位點 g。56T>C與 SCS(P＜0.05)和ACH50(P＜0.01)值都具有顯著相關(guān)性，位點g。7017C>T與 ACH50值有極顯著相關(guān)性(P＜0.01)，上述結(jié)果表明 SNP

13、位點g。56T>C和g。7017C>T可作為補體活性性狀的分子標(biāo)記。單倍型組合為H2H4(CCT/CTT)的牛群比其他牛有更高的CH50值；H1H2(CCC/CCT)比H1H3(CCC/CTC)和H3H7(CTC/GTC)有顯著高的ACH50值(P＜0.01)。上述結(jié)果顯示牛C3基因單倍型組合H1H2(CCC/CCT)和H2H4(CCT/CTT)可作為未來補體活性性狀的分子標(biāo)記。但我們試驗結(jié)果僅是初步的，還需對C3基因5’側(cè)翼區(qū)和C3蛋