P66Shc介導(dǎo)的線粒體動力學(xué)變化在糖尿病腎病腎小管氧化損傷中的研究.pdf

1、研究背景:糖尿病腎病（diabeticnephropathy，DN）是慢性腎臟病中最常見的繼發(fā)性病因，也是引起終末期腎臟疾病(ESRD)的主要原因之一。腎小管細(xì)胞的氧化損傷和凋亡是DN早期的主要臨床特征之一，其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。近期研究證明:線粒體形態(tài)功能異常引起的線粒體動力學(xué)變化和線粒體ROS的過量產(chǎn)生在其中可能起著關(guān)鍵作用，且兩者關(guān)系密切。銜接蛋白p66Shc是誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡，以及調(diào)節(jié)生命周期的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的重要分子。在

2、高葡萄糖刺激下，p66Shc被激活并轉(zhuǎn)位至線粒體，引起線粒體ROS過量產(chǎn)生并介導(dǎo)腎小管細(xì)胞的氧化損傷和凋亡。但在糖尿病環(huán)境中:DN患者的腎小管細(xì)胞是否發(fā)生線粒體動力學(xué)變化仍缺乏證據(jù);線粒體片段化和線粒體ROS過度產(chǎn)生的因果關(guān)系尚不明確，以及p66Shc是否通過介導(dǎo)線粒體動力學(xué)變化這一新途徑引起DN腎小管細(xì)胞氧化損傷和凋亡仍有待闡明。因此，本課題將圍繞這三個具體問題展開研究。
　　 目的:觀察DN患者腎組織中小管細(xì)胞的線粒體動力學(xué)

3、變化和氧化損傷，及p66Shc和線粒體動力學(xué)調(diào)控蛋白的表達(dá)，從而尋找DN腎小管損傷的病因和機(jī)制。在體外實驗中進(jìn)一步研究在高葡萄糖刺激下線粒體片段化的分子機(jī)制及其和線粒體ROS過度產(chǎn)生的因果關(guān)系;并探討p66Shc是否作為兩者聯(lián)系的樞紐，通過介導(dǎo)線粒體片段化進(jìn)而導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞氧化損傷和凋亡的機(jī)制。
　　 方法:
　　 1、選取DN和對照組微小病變患者各10例，常規(guī)HE、PAS和PASM染色觀察兩組腎活檢組織中腎小球和腎

4、小管的病理改變，應(yīng)用電鏡觀察腎小管細(xì)胞線粒體超微形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，DHE染色檢測腎組織中ROS水平，并通過免疫組化及免疫熒光方法檢測兩組腎組織中p66Shc蛋白，線粒體分裂蛋白Drp1和融合蛋白Mfn1的表達(dá)情況。
　　 2、體外培養(yǎng)人腎小管上皮細(xì)胞HK-2，經(jīng)MitoRed染色在共聚焦顯微鏡下觀察不同濃度和時間葡萄糖刺激下的線粒體動力學(xué)變化，并行WesternBlot檢測Drp1和Mfn1的相應(yīng)蛋白表達(dá)變化。應(yīng)用mdivi-1抑制

5、Drp1表達(dá)，免疫熒光顯微鏡檢測低糖和高糖環(huán)境下HK-2細(xì)胞Drp1表達(dá)、線粒體動力學(xué)和線粒體ROS產(chǎn)生的變化。進(jìn)一步通過轉(zhuǎn)染p66Shc野生型或siRNA質(zhì)粒，分析其對Drp1表達(dá)、線粒體動力學(xué)和ROS產(chǎn)生的影響和機(jī)制。
　　 結(jié)果:
　　 1、患者腎活檢組織常規(guī)病理染色顯示:與對照組微小病變患者比較，DN患者腎組織有明顯結(jié)節(jié)性或彌漫性腎小球硬化，腎小管可見空泡變性和基底膜增厚，并有明顯小管硬化和萎縮。電鏡示DN患者腎

6、小球較之對照組，基底膜增厚以及腎小管細(xì)胞線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)出現(xiàn)顯著片段化改變(P＜0.05);DHE染色顯示DN患者腎組織ROS水平明顯升高;免疫組化和免疫熒光檢測證實:與對照組比較，p66Shc和Drp1蛋白表達(dá)明顯升高，而Mfn1的表達(dá)降低(P＜0.05）。
　　 2、在HK-2細(xì)胞中，線粒體形態(tài)在低糖環(huán)境下呈細(xì)絲狀，而在高糖刺激下轉(zhuǎn)變?yōu)槎贪艋蝾w粒狀，且隨刺激時間延長，出現(xiàn)線粒體片段化的細(xì)胞數(shù)顯著增多(P＜0.05)，同時調(diào)控線

7、粒體動力學(xué)的分裂蛋白Drp1和融合蛋白Mfn1在高糖刺激下的表達(dá)變化呈時間和劑量依賴性。用Drp1抑制劑mdivi-1干預(yù)后，高糖+mdivi-1組比高糖組細(xì)胞的Drp1表達(dá)下降，發(fā)生線粒體片段化的細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞內(nèi)線粒體ROS水平均明顯降低(P＜0.05)。進(jìn)一步轉(zhuǎn)染p66Shc質(zhì)粒后顯示:與低糖組比較，低糖+野生型p66Shc質(zhì)粒組的細(xì)胞內(nèi)Drp1表達(dá)升高，線粒體片段化增多，且線粒體ROS水平升高，而加入mdivi-1干預(yù)后，上述變化

8、均有減弱;在高糖環(huán)境下，高糖+p66ShcsiRNA組較之高糖+空質(zhì)粒組，Drp1表達(dá)降低，線粒體片段化程度減輕，且線粒體ROS水平下降。這些提示p66Shc可通過影響Drp1的活性來介導(dǎo)線粒體動力學(xué)變化，進(jìn)而引起線粒體ROS過量產(chǎn)生。
　　 結(jié)論:
　　 該研究首次在DN患者腎活檢組織中證實了腎小管細(xì)胞發(fā)生線粒體片段化，伴隨著線粒體動力學(xué)調(diào)控蛋白的表達(dá)變化和細(xì)胞內(nèi)ROS的過量產(chǎn)生。并闡明了p66Shc可能通過影響Drp