金蓮花中葒草苷對人紅細胞氧化損傷及自然老化的保護作用.pdf

1、在人體不同類型細胞中，紅細胞是機體血液循環(huán)系統(tǒng)中數(shù)量最多的有形成分，紅細胞膜富含脂質和蛋白質，紅細胞的完整性是保證機體正常生理功能的結構基礎。研究表明，過量的氧自由基氧化細胞膜上的不飽和脂肪酸，產生具有很強生物毒性的羰基化合物，而羰基化合物極易與細胞膜磷脂、蛋白質等發(fā)生羰-氨交聯(lián)反應，造成細胞膜結構的破壞和生理功能的喪失，最終導致細胞凋亡和老化死亡，這一過程是機體衰老損傷的核心過程，甚至是機體衰老改變的生化本質?，F(xiàn)代藥理研究表明，許多中

2、草藥有效成分具有對紅細胞的保護作用，其中以黃酮類研究最為廣泛，黃酮類化合物對紅細胞保護作用機制主要是通過提高抗氧化酶活性，保護紅細胞形態(tài)以及細胞膜骨架結構功能來實現(xiàn)的。
　　葒草苷在金蓮花總黃酮中含量較高，屬于黃酮碳苷類。其結構為3'，4'，5，7-四羥基黃酮-8-D-吡喃葡萄糖苷。研究表明，葒草苷具有體外清除氧自由基作用，對D-半乳糖致衰老小鼠海馬區(qū)神經細胞結構的功能以及對缺血性心肌細胞損傷具有保護作用。葒草苷對紅細胞氧化損傷以

3、及自然老化的保護作用研究尚未見報道。本研究建立體外紅細胞氧化損傷模型及紅細胞自然衰老模型，以維生素C為陽性對照，研究比較葒草苷及其苷元木犀草素對人紅細胞的保護作用機制，確立物構效關系。
　　建立H2O2誘導紅細胞脂質過氧化損傷模型。實驗分正常組、模型組、葒草苷預保護組(10，20，40μg·mL-1)、木犀草素預保護組(10，20，40μg·mL-1)、維生素C對照組(20μg·mL-1)。檢測各組紅細胞溶血率、活性氧(React

4、ive oxygen species，ROS)、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(Catalase，CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-Px)、Na+-K-ATPs、Ca2+-Mg2+-ATPs，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析膜蛋白，掃描電鏡(Scanning electro

5、n microscopy，SEM)觀察紅細胞表面形態(tài)，透射電鏡(Transmission electronmicroscope，TEM)觀察紅細胞膜骨架結構。
　　建立紅細胞自然老化模型，紅細胞37℃孵育48h。實驗分正常組、模型組、葒草苷預保護組（10，20，40μg·mL-1）、木犀草素預保護組(10，20，40μg·mL-1)、維生素C對照組(20μg·mL-1)。檢測各組紅細胞溶血率、MDA、SOD、CAT、GSH-Px、

6、 Na+-K+-ATPs、Ca2+-Mg2+-ATPs、唾液酸(Sialic acid，SA)，SDS-PAGE分析膜蛋白，SEM觀察紅細胞表面形態(tài)變化，TEM觀察紅細胞膜骨架結構。
　　結果表明:
　　1、葒草苷對氧化損傷及自然老化紅細胞溶血率的影響
　　H2O2誘導紅細胞氧化損傷，模型組溶血率增大，與正常組相比有顯著性差異(P＜0.01);葒草苷、木犀草素、維生素C均可不同程度抑制紅細胞溶血，與模型組相比有顯著性差

7、異(P＜0.05，P＜0.01)，且與濃度呈正相關;與木犀草素相比，葒草苷10，20μg·mL-1濃度組紅細胞溶血率高于木犀草素同濃度組，有顯著性差異(P＜0.05，P＜0.01)，二者40μg·mL-1濃度組相比無顯著性差異;與維生素C相比，葒草苷與木犀草素10，20μg·mL-1濃度組紅細胞溶血率高于維生素C20μg·mL-1濃度組，有顯著性差異(P＜0.05，P＜0.01)，二者40μg·mL-1濃度組與維生素C相比無顯著性差異;

8、
　　紅細胞37℃孵育48h后，模型組紅細胞溶血率升高，與正常組相比有顯著性差異(P＜0.01);葒草苷、木犀草素、維生素C均可不同程度抑制紅細胞溶血，與模型組相比具有顯著性差異(P＜0.05，P＜0.01);與木犀草素相比，葒草苷10，20μg·mL-1濃度組紅細胞溶血率高于木犀草素同濃度組，有顯著性差異(P＜0.05，P＜0.01)，二者40μg·mL-1濃度組相比無顯著性差異;與維生素C相比，葒草苷與木犀草素10，20μg·

9、mL-1濃度組紅細胞溶血率高于維生素C20μg·mL-1濃度組組，有顯著性差異(P＜0.05，P＜0.01)，二者40μg·mL-1濃度組與維生素C組相比無顯著性差異;
　　2、葒草苷對氧化損傷及自然老化紅細胞ROS、MDA、抗氧化酶、ATPs及SA的影響
　　2.1葒草苷對氧化損傷紅細胞ROS、MDA、抗氧化酶、ATPs的影響
　　H2O2誘導紅細胞氧化損傷，模型組ROS熒光強度增大，MDA含量升高，抗氧化酶(SOD

10、、CAT、GSH-PX)活性降低，ATPs(Na+-K+-ATPs、Ca2+-Mg2+-ATPs)活性降低，與正常組相比，各指標均有顯著性差異(P＜0.01);給予葒草苷、木犀草素、維生素C預處理后，各給藥組ROS熒光強度均有不同程度減弱，MDA含量均有不同程度降低，抗氧化酶活性及ATPs活性均有不同程度升高，且與濃度呈正相關。
　　與模型組相比，葒草苷10μg·mL-1濃度組ROS、SOD、CAT、Na+-K+-ATPs有顯著性

11、差異（P＜0.05，P＜0.01），MDA、GSH-Px、Ca2+-Mg2+-ATPs無顯著性差異，葒草苷20，40μg·mL-1濃度組各指標均有顯著性差異(P＜0.05，P＜0.01);與模型組相比，木犀草素10，20，40μg·mL-1濃度組各指標均有顯著性差異(P＜0.05，P＜0.01);
　　與木犀草素相比，葒草苷10，20μg·mL-1濃度組在降低ROS熒光強度，降低MDA含量，提高SOD、GSH-Px、Ca2+-Mg

12、2+-ATPs活力上弱于木犀草素同濃度組，具有顯著性差異(P＜0.05，P＜0.01)，CAT、Na+-K+-ATPs無顯著性差異;二者40μg·mL-1濃度組相比各指標均無顯著性差異;
　　與維生素C相比，葒草苷與木犀草素10，20μg·mL-1濃度組在降低ROS熒光強度，降低MDA含量，提高SOD、GSH-Px、Ca2+-Mg2+-ATPs活力上均弱于維生素C20μg·mL-1濃度組，具有顯著性差異(P＜0.05，P＜0.01

13、)，CAT、Na+-K+-ATPs無顯著性差異;二者40μg·mL-1濃度組與維生素C相比各指標無顯著性差異。
　　2.2葒草苷對自然老化紅細胞MDA、抗氧化酶、ATPs及SA的影響
　　紅細胞37℃孵育48h后，模型組紅細胞MDA含量升高，抗氧化酶及ATPs活性降低，SA含量降低，與正常組相比，各指標均具有顯著性差異（P＜0.01）;給予葒草苷、木犀草素、維生素C預處理后，各給藥組MDA含量均有不同程度降低，抗氧化酶及AT

14、Ps活性均有不同程度升高，SA含量也有不同程度升高，與模型組相比，各指標均有顯著性差異(P＜0.05，P＜0.01)，并與濃度呈正相關;
　　與木犀草素相比，葒草苷10，20μg·mL-1濃度組在降低MDA含量，提高抗氧化酶及ATPs活力，提高SA含量上弱于木犀草素同濃度組，具有顯著性差異(P＜0.05，P＜0.01)，二者40μg·mL-1濃度組相比各指標無顯著性差異;
　　與維生素C相比，葒草苷與木犀草素10，20μg·

15、mL-1濃度組在降低MDA含量，提高抗氧化酶及ATPs活力，提高SA含量上均弱于維生素C20μg·mL-1濃度組，具有顯著性差異(P＜0.05，P＜0.01)，二者40μg·mL-1濃度組與維生素C相比各指標無顯著性差異。
　　3、葒草苷對氧化損傷及自然老化紅細胞膜蛋白的影響
　　紅細胞氧化損傷后，模型組蛋白條帶變窄，血影蛋白(spectrin)、錨定蛋白（ankyrin）、帶3蛋白(band3 protein)、帶4.1

16、a(band4.1 a protein)帶4.1b蛋白(band4.1b protein)、肌動蛋白(actin)均有不同程度的減弱甚至消失，與正常組有明顯差別。給予葒草苷后，帶3蛋白、帶4.1a蛋白、肌動蛋白有所恢復，給予木犀草素后，血影蛋白、帶3蛋白、帶4.1a蛋白、肌動蛋白有所恢復，給予維生素C后，血影蛋白、錨定蛋白、帶3蛋白、帶4.1a蛋白、帶4.1b蛋白、肌動蛋白均有所恢復，且蛋白恢復程度與濃度呈正相關，葒草苷蛋白恢復程度均低

17、于木犀草素同濃度組，木犀草素40μg·mL-1濃度組與維生素C20μg·mL-1濃度組蛋白恢復程度較好。
　　紅細胞孵育48h后，模型組血影蛋白、錨定蛋白有聚集現(xiàn)象，帶4.1a蛋白有所增加，帶4.1b蛋白有所減少，4.1a/4.1b有所增大，與正常組有區(qū)別。給予葒草苷、木犀草素、維生素C預處理后，血影蛋白、錨定蛋白條帶均有所恢復，4.1a/4.1b均有所降低，各組間差異不大。
　　4、葒草苷對氧化損傷及自然老化紅細胞表面形態(tài)

18、的影響
　　紅細胞氧化損傷及自然老化后，模型組紅細胞表面形態(tài)發(fā)生變化，大部分紅細胞皺縮，表面伸出很多棘狀突起，邊緣有鋸齒狀突起，并且紅細胞大多粘連，還有少部分紅細胞呈扁平瓜子樣，細胞中心凹陷或呈平板狀，較正常紅細胞薄，與正常組相比有明顯差別。給予葒草苷、木犀草素、維生素C預處理后紅細胞形態(tài)逐漸恢復，表面棘突逐漸變細變小，棘紅細胞數(shù)目變少，邊緣比較整齊，且細胞恢復程度與濃度呈正相關。
　　5、葒草苷對氧化損傷及自然老化紅細胞膜

19、骨架的影響
　　紅細胞氧化損傷及自然老化后，模型組紅細胞膜骨架結構模糊，沒有網絡狀結構，J點不清晰，SP4結構缺失斷裂或形成碎片，網絡間纖維發(fā)生聚集，粗細不一，分布不均，結構難辨，與正常組相比有顯著性差異。給予葒草苷、木犀草素、維生素C預保護后，紅細胞膜骨架J點逐漸恢復，SP4逐漸變得完整有序，膜骨架間的空洞逐漸變小，網絡骨架結構逐漸出現(xiàn)，且膜骨架恢復程度與濃度呈正相關。葒草苷與木犀草素高濃度組及維生素C組，J點和SP4都比較清晰