透明質(zhì)酸通過p38 MAPK和JNK信號(hào)通路影響腎小管上皮細(xì)胞粘附性在尿石形成中的機(jī)制研究.pdf

1、第一部分 目的:探討草酸和一水草酸鈣對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞HK-2細(xì)胞的毒性作用。
　　方法:共培養(yǎng)體系培養(yǎng)HK-2細(xì)胞至長滿后,使用不同濃度(0,1,5和10mmol/L)的草酸和一水草酸鈣處理HK-2細(xì)胞24h,通過檢測細(xì)胞培養(yǎng)基中的乳酸脫氫酶LDH的含量和DAPI染色結(jié)果分析草酸及一水草酸鈣對(duì)細(xì)胞的毒性作用。
　　結(jié)果:DAPI染色顯示草酸濃度在0-5mmol/L時(shí),細(xì)胞數(shù)目沒明顯變化,5mmol/L時(shí)個(gè)別細(xì)胞的細(xì)胞核呈固

2、縮狀,草酸濃度10mmol/L時(shí),細(xì)胞數(shù)目開始明顯減少。一水草酸鈣濃度在1mmol/L時(shí)細(xì)胞數(shù)目就開始明顯減少,5mmol/L和10mmol/L時(shí)細(xì)胞基本死亡。5mmol/L和10mmol/L草酸在處理HK-2細(xì)胞24h后培養(yǎng)基中的LDH含量顯著高于未處理組(p<0.01)。1mmol/L、5mmol/L和10mmol/L一水草酸鈣組培養(yǎng)基中LDH含量均顯著高于未處理組(p<0.01)。
　　結(jié)論:草酸和一水草酸鈣對(duì)HK-2細(xì)胞的

3、毒性呈濃度相關(guān)性。一水草酸鈣晶體相比較草酸更具有細(xì)胞毒性。
　　第二部分:
　　目的:探討一水草酸鈣晶體(calciumoxalatemonohydrate,COM)通過對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞HK-2的作用能否激活MAPK信號(hào)通路,通過拮抗MAPK信號(hào)通路能否減少透明質(zhì)酸合成酶、CD44的產(chǎn)生以及能否抑制COM晶體對(duì)細(xì)胞的粘附作用。
　　方法:HK-2細(xì)胞在饑餓處理12h后分別在不同時(shí)間點(diǎn)(0min、15min、30min

4、、1h和2h)暴露在COM晶體(1mmol/L)及陽性對(duì)照下。檢測p38MAPK、JNK和ERK蛋白的磷酸化情況。p38MAPK通路的抑制劑SB203580對(duì)細(xì)胞進(jìn)行干預(yù),通過westernblot和RT-PCR技術(shù)檢測p38-MAPK磷酸化情況及透明質(zhì)酸合成酶1-3和CD44的mRNA表達(dá)情況。通過離子色譜儀檢測COM晶體與腎小管上皮細(xì)胞的粘附情況。
　　結(jié)果:HK-2細(xì)胞在饑餓處理12h后,COM晶體(1mmol/L)能快速的

5、、充分的激活p38MAPK信號(hào)通路。COM晶體能輕度激活JNK信號(hào)途徑但是無法激活ERK信號(hào)途徑。通過使用p38MAPK信號(hào)途徑的抑制劑SB203580(50μM)能夠充分阻滯p38MAPK信號(hào)通路的激活并且能夠降低透明質(zhì)酸合成酶1-3和CD44的mRNA表達(dá)以及減少腎小管上皮細(xì)胞與COM晶體的粘附。
　　結(jié)論:一水草酸鈣晶體能夠選擇性激活p38MAPK和JNK信號(hào)途徑。p38MAPK信號(hào)通路抑制劑SB203580能夠降低透明質(zhì)酸

6、合成酶1-3和CD44的mRNA表達(dá)以及減少腎小管上皮細(xì)胞與COM晶體的粘附。
　　第三部分:
　　目的:觀察透明質(zhì)酸(HA)、CD44及透明質(zhì)酸合成酶(HAS1-3)在結(jié)石患者腎組織中的表達(dá),著重探討HAS1在一水草酸鈣晶體(calciumoxalatemonohydrate,COM)和人腎小管上皮細(xì)胞在粘附過程中的作用。
　　方法:通過免疫組化的方法,檢測結(jié)石患者腎組織和正常腎組織中CD44、HAS1-3和HA的表

7、達(dá)差異。通過RT-PCR和westernblot檢測HK-2細(xì)胞在分別在不同時(shí)間點(diǎn)(0h、24h、48h)暴露在COM晶體(1mmol/L)下HAS1的mRNA和蛋白表達(dá)情況。通過ELISA方法,檢測HK-2細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)(0h、12h、24h、36h、48h)暴露于COM晶體后培養(yǎng)基中HA的含量。通過干擾HAS1,檢測其對(duì)HA的合成以及對(duì)腎小管上皮與COM晶體粘附力的影響。通過共聚焦顯微鏡和離子色譜儀檢測COM晶體與腎小管上皮細(xì)胞的

8、粘附情況。
　　結(jié)果:免疫組化結(jié)果顯示在結(jié)石患者腎組織中,CD44、HAS1-3及HA比正常腎組織都有明顯升高。HK-2細(xì)胞在COM晶體(1mmol/L)處理24h后,HAS1-3和CD44的mRNA表達(dá)最高,48h后下降,其中HAS1的表達(dá)升高最明顯。HK-2細(xì)胞在COM晶體(1mmol/L)處理24h后HAS1的蛋白含量開始升高,48h達(dá)到最高。通過對(duì)HAS1的siRNA干擾能充分的降低HAS1的表達(dá)。HK-2細(xì)胞在COM晶體

9、(1mmol/L)處理24h后組織培養(yǎng)基中的HA的含量達(dá)到最高,其后開始下降。熒光共聚焦染色和離子色譜儀結(jié)果顯示,通過抑制HAS1的表達(dá)可以大大降低腎小管上皮細(xì)胞與COM晶體的粘附。
　　結(jié)論:結(jié)石患者腎組織中CD44、HAS1-3和HA都有高表達(dá)。透明質(zhì)酸在COM晶體與腎小管上皮的粘附過程中起到非常重要的作用,通過抑制HAS1的表達(dá)可以減少HA的表達(dá)從而降低腎小管上皮細(xì)胞對(duì)COM晶體的粘附。
　　第四部分:
　　目的

10、:長鏈非編碼RNAs(lncRNAs)具有非常重要的生物功能。本研究通過lncRNA芯片研究一水草酸鈣刺激人近端腎小管后lncRNAs的變化,為將來結(jié)石形成機(jī)制的研究提供候選lncRNAs。
　　方法:通過lncRNA芯片檢測1mmol/L一水草酸鈣刺激人近端腎小管HK-2細(xì)胞24h后長鏈非編碼RNA的變化情況。通過qPCR的方法驗(yàn)證芯片結(jié)果。
　　結(jié)果:經(jīng)過1mmol/L一水草酸鈣刺激人近端腎小管HK-2細(xì)胞24h后297

11、1條lncRNAs發(fā)生了變化,其中上調(diào)1630條,下調(diào)1341條。通過qPCR的方法驗(yàn)證了4條lncRNAs(ENST00000430583、ENST00000428930、NR_029401和chr13)。結(jié)果顯示qPCR結(jié)果和基因芯片結(jié)果具有良好的一致性。
　　結(jié)論:本研究首次報(bào)道腎小管上皮細(xì)胞經(jīng)一水草酸鈣刺激24h后lncRNAs的變化,結(jié)果中表達(dá)有差異的lncRNAs可能在結(jié)石形成過程中有巨大的作用。綜上所述,本研究為結(jié)石