metK對(duì)那西肽生物合成的影響和鏈霉菌高效轉(zhuǎn)座系統(tǒng)的構(gòu)建.pdf

1、第一部分
　　 世界上三分之二的抗生素由鏈霉菌產(chǎn)生，因而鏈霉菌在大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)和化學(xué)合成酶方面有特殊作用。鏈霉菌基因工程的研究近年來(lái)是一個(gè)活躍的領(lǐng)域。本論文研究著眼于那西肽，這是一種含有多個(gè)噻唑環(huán)并富含硫元素的非核糖體肽類抗生素，由活躍鏈霉菌Streptomyces.actuosus產(chǎn)生。本研究在鏈霉菌育種方法的基礎(chǔ)上，主要利用基因工程和培養(yǎng)基組分優(yōu)化的方法來(lái)研究那西肽生物合成的代謝途徑以進(jìn)一步提高那西肽的產(chǎn)量，適于工業(yè)生產(chǎn)的需

2、要。
　　 首先，構(gòu)建含有來(lái)源于釀酒酵母的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因metK的大腸桿菌-鏈霉菌穿梭質(zhì)粒，通過(guò)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化將其克隆至S.actuosus，構(gòu)建成基因工程菌Z-SAM，并用高效液相(HPLC)證明了S-腺苷甲硫氨酸(SAM)在該株菌中的含量比出發(fā)菌株Z-10提高了9倍，達(dá)到9.5μg/ml。
　　 其次，為探索那西肽的生物合成代謝途徑，本研究對(duì)S.actuosus發(fā)酵培養(yǎng)基組分進(jìn)行了優(yōu)化，有針對(duì)性的提高培養(yǎng)基

3、中的碳源和氮源，采用2％麥芽糖，2％葡萄糖，4％淀粉，4％黃豆粉，0.25％硫酸銨，0.2％硫酸鈉，0.04％K2HPO4，0.01％MnSO4，0.05％MgSO4，0.25％NaCl，0.003％FeSO4，0.005％ZnSO4作為發(fā)酵培養(yǎng)基，并分別在72，120和168小時(shí)時(shí)補(bǔ)加2％黃豆粉，0.01％絲氨酸，1.25％麥芽糖，1.25％葡萄糖，0.15％硫酸鈉和0.15％硫酸銨。在發(fā)酵終止后發(fā)現(xiàn)基因工程菌Z-SAM的那西肽產(chǎn)量較

4、出發(fā)菌株提高了80％，菌株生產(chǎn)穩(wěn)定，發(fā)酵單位達(dá)到1746μg/ml。
　　 最后，本論文發(fā)現(xiàn)Z-SAM菌體中半胱氨酸的含量比出發(fā)菌株Z-10提高了一倍，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果和文獻(xiàn)報(bào)道的SAM逆轉(zhuǎn)硫途徑，本研究推測(cè)在S.actuosus中存在另一條由SAM主導(dǎo)的逆轉(zhuǎn)硫合成那西肽的途徑。即由于S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMs)的高表達(dá)導(dǎo)致SAM大量產(chǎn)生，SAM激活了該合成途徑，并在其中起到硫提供者的角色，在通過(guò)了一系列代謝后使得菌體內(nèi)半胱氨

5、酸含量提高。而半胱氨酸是那西肽生物合成的重要前體，所以進(jìn)而使得那西肽的產(chǎn)量提高。
　　 第二部分
　　 隨著天藍(lán)色鏈霉菌A3(2)的全基因組序列的發(fā)表，鏈霉菌的基礎(chǔ)研究已進(jìn)入后基因組時(shí)代，大量新基因和功能未知基因的功能有待鑒定。對(duì)這類基因的研究將會(huì)為闡明初生代謝和次生代謝的基因調(diào)控等生物學(xué)問(wèn)題以及次生代謝藥物的合成機(jī)制提供更多的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。因此大規(guī)模突變體庫(kù)的構(gòu)建是功能基因組研究的一個(gè)重要內(nèi)容，而利用轉(zhuǎn)座子進(jìn)行插入突變構(gòu)建

6、突變體庫(kù)則是目前廣泛應(yīng)用的方法之一。
　　 轉(zhuǎn)座子是基因功能研究十分有用的工具。但目前在鏈霉菌中應(yīng)用的大多數(shù)轉(zhuǎn)座子卻普遍存在轉(zhuǎn)座效率低下或操作繁瑣等缺點(diǎn)。本研究利用天然存在于諾卡氏菌Nocardia asteroids(mexicana)YP21中的轉(zhuǎn)座子IS204，成功構(gòu)建了一個(gè)鏈霉菌中的微型轉(zhuǎn)座質(zhì)粒pDZY101。該質(zhì)粒帶有大腸桿菌與鏈霉菌進(jìn)行屬間接合轉(zhuǎn)移的起始位點(diǎn)oriT，可通過(guò)簡(jiǎn)單的接合轉(zhuǎn)移將其從大腸桿菌導(dǎo)入到鏈霉菌中。

7、實(shí)驗(yàn)證明該轉(zhuǎn)座系統(tǒng)克服了鏈霉菌中現(xiàn)有轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)的一些缺陷，操作簡(jiǎn)便且具有高效、隨機(jī)、遺傳穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。此外本論文在pDZY101的基礎(chǔ)構(gòu)建了一系列衍生質(zhì)粒對(duì)轉(zhuǎn)座酶的作用機(jī)制進(jìn)行了初步研究，證明了IS204的轉(zhuǎn)座酶在鏈霉菌中只能識(shí)別帶有一對(duì)緊挨著的反向重復(fù)序列的環(huán)狀片斷，并進(jìn)而推測(cè)IS204的轉(zhuǎn)座過(guò)程涉及到一個(gè)環(huán)狀中間體。通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)座突變株的大量測(cè)序和Southern雜交實(shí)驗(yàn)證實(shí)該轉(zhuǎn)座系統(tǒng)隨機(jī)性非常好，而且具有良好的遺傳穩(wěn)定性。這些特點(diǎn)使得該