vgb基因和bldD基因在活躍蓮霉菌中的過表達及其對諾西肽產(chǎn)量的研究.pdf

1、諾西肽(Nosiheptide，Nos)又稱那西肽，是由活躍鏈霉菌（Streptomycesactuosus）產(chǎn)生的一種含硫多肽類抗生素，與鹽屋霉素、微球菌素、高硫青霉素、硫鏈絲菌肽及GE2270A等同屬于硫肽類抗生素。它主要抑制革蘭氏陽性菌的生長，最低抑制濃度僅為8ng/mL，對部分革蘭氏陰性菌及少量病毒也有一定的抑制作用。由于諾西肽具有毒副作用低，抑菌活性高及無殘留等優(yōu)點，已被開發(fā)為一種新型飼料添加劑，廣泛應(yīng)用于促進禽畜的生長以及疾

2、病的預(yù)防控制等領(lǐng)域，但產(chǎn)量較低一直限制其廣泛應(yīng)用的主要因素，本研究主要通過表達外源基因來提高諾西肽的產(chǎn)量，但是產(chǎn)量較低一直是限制其廣泛應(yīng)用的主要因素，本研究主要通過表達外源基因來提高諾西肽的產(chǎn)量。
　　 血紅蛋白是一種能與O2進行可逆性地結(jié)合，廣泛存在于動物、植物及微生物中的球蛋白。Vitreoscillahemoglobin(VHb)是存在于透明顫菌屬的血紅蛋白，當O2濃度較低的情況下可以被大量誘導表達，以滿足貧氧條件下對氧氣

3、的需求。隨著基因工程的不斷發(fā)展，發(fā)現(xiàn)表達VHb的vgb基因不僅能夠在大腸桿菌中穩(wěn)定存在和表達，而且還可以在真菌、假單胞菌、鏈霉菌等中成功表達，能顯著提高α-淀粉酶、放線紫紅素、紅霉素等次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。
　　 bld基因家族是鏈霉菌中的全局性調(diào)控基因，目前已確定其成員包括bldA、bldB、bldC、bldD、bldH及bldK等，其中bldD基因?qū)π螒B(tài)分化及抗生素的形成的調(diào)控作用較為明顯。在天藍色鏈霉菌中敲除bldD基因后，

4、突變體由于缺少氣生菌絲表現(xiàn)出“光禿”表型，而且所產(chǎn)生的放線菌紫素、十一烷基靈菌紅素、鈣依賴的抗生素都受到了不同程度的抑制;在糖多孢紅霉菌中敲除該基因后，紅霉素的合成能力會大大下降，且在糖多孢紅霉菌中過表達bldD基因可以明顯提高紅霉素的產(chǎn)量。
　　 本研究首先對S.actuosus的孢子種進行稀釋涂板，挑取不同的克隆分別發(fā)酵，利用分光光度計法測定其諾西肽的產(chǎn)量，進而篩選出良好的出發(fā)菌株。然后利用PEG的介導作用將表達性載體pZM

5、，pZM-vgb，pZMW和pZMW-vgb分別轉(zhuǎn)化到S.actuosus的原生質(zhì)體中，成功構(gòu)建了S.actuosus/pZM，S.actuosus/pZM-vgb，S.actuosus/pZMW及S.actuosus/pZMW-vgb四種工程菌株。將S.actuosus出發(fā)菌株及相應(yīng)工程菌株同時接到SFM大斜面上進行活化，然后轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)，通過對枯草芽孢桿菌的抑菌活性分析及分光光度計法對其諾西肽含量進行定量測定，發(fā)現(xiàn)

6、在S.actuosus中整合型表達vgb基因可以使諾西肽的產(chǎn)量提高50％。
　　 本研究還首次將鏈霉菌中的全局性調(diào)控基因bldD成功地轉(zhuǎn)化到S.actuosus中，構(gòu)建S.actuosus/pZMW-bldD，利用同樣的檢測手段對S.actuosus出發(fā)菌株及S.actuosus/pZMW-bldD菌株中的諾西肽進行測定，發(fā)現(xiàn)bldD基因可以穩(wěn)定地整合到S.actuosus中，并且發(fā)現(xiàn)過表達bldD基因可以將諾西肽的產(chǎn)量提高68