大鼠膿毒癥肝損傷時巨噬細胞移動抑制因子(MIF)、白介素10(IL-10)的表達和意義.pdf

1、目的：膿毒癥是由于感染而誘發(fā)的全身性炎癥反應，是外科常見的并發(fā)癥。膿毒癥早期如果持續(xù)的全身性炎癥反應得不到有效的控制，常常并發(fā)多臟器功能不全綜合癥(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)，而MODS的終末表現(xiàn)是形成多臟器功能衰竭(multiple organ failure，MOF)，這是需要外科監(jiān)護的重癥患者死亡的主要原因。盡管現(xiàn)代外科監(jiān)護技術(shù)和抗生素治療有了很大發(fā)展，但是，膿毒癥的死亡率仍

2、然很高，文獻報道在非休克患者中，其死亡率為30％—40％，而在休克患者中其死亡率則達到70％—90％，因此，膿毒癥及其并發(fā)的臟器功能不全的防治，仍然是當代外科學領域的熱點研究方向和尚待攻克的難題之一。 感染所致的全身炎癥反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)是大量促炎性細胞因子過度活化所引起的全身炎癥反應已是多數(shù)學者的共識，近年來又發(fā)現(xiàn)在炎性細胞因子產(chǎn)生的同時伴有多

3、種抗炎因子如白細胞介素10(IL-10)、白細胞介素4(IL—4)等的釋放，過量抗炎因子會導致代償性抗炎反應綜合征(compensatory anti—inflammatory response syndrome，CARS)，繼而導致過度的免疫抑制而使感染失控。最近的研究中，發(fā)現(xiàn)在促炎細胞因子中，巨噬細胞移動抑制因子(macrophage migration inhibitor factor，MIF)被認為是炎癥發(fā)生發(fā)展的始動環(huán)節(jié)，它可

4、以誘導生成多種炎性細胞因子的產(chǎn)生如腫瘤壞死因子(TNF—α)、白細胞介素1(IL-1)、白細胞介素6(IL—6)等，從而引發(fā)炎癥細胞因子的級聯(lián)釋放，進而對機體的炎癥反應形成級聯(lián)放大效應。IL-10是一種重要的內(nèi)源性抗炎細胞因子，參與抑制細胞合成炎性因子，在膿毒血癥的病理生理過程中起著維持炎癥平衡，防止炎癥過度而造成器官損傷的作用。本項目研究的目的在于為研究膿毒癥肝臟損傷中此兩種炎癥因子的表達水平及損傷機制方面提供新的實驗依據(jù)，為臨床防治

5、和預測膿毒癥轉(zhuǎn)歸提供新的線索。 方法：1.應用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)(CLP)建立大鼠膿毒癥病理模型。選用SD大鼠，3-5月齡，體重180-250克，雄性，由中山大學實驗動物中心提供。將動物分為二組(實驗組、對照組)，在不同時相(2h、6h、12h、24h)分別取材。2.取出部分肝臟組織置于10％的甲醛中固定，常規(guī)病理檢查，HE染色，觀察肝臟組織在不同時間組的過程中病理結(jié)構(gòu)改變。另外一部分置于凍存管，—80℃低溫冰箱保存。3.抽取大鼠血

6、液，離心后提取血清，置于EP管放入—20℃冰箱保存。取出一部分應用血液生化分析方法檢測各個時相組大鼠血液中ALT、TBIL的變化。4.按照酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法試劑盒說明書步驟操作，最后置于酶標儀上檢測其OD值，做出標準曲線計算血液中MIF、IL-10水平。 5.應用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT—PCR)檢測肝臟組織MIF、IL-10在mRNA上的表達水平的變化：通過TRIZOL法提取肝臟組織RNA(Invitrogen)，

7、逆轉(zhuǎn)錄為cDNA(Fermentas)，運用PCR儀擴增出DNA(體系25μl)： IL-10引物：上游5’—CTGGACAACATACTGCTAACCGAC—3’，下游5’—ATTCATTCATGGCCTTGTA—GACACC—3’，MIF引物：上游5'—CCGTGCCAGAGGGGTTT—3’，下游5’—GGCTGC—GTTCATGTCGTAA—3’，內(nèi)參為β—actin。循環(huán)條件：94℃30sec，55℃30sec，72℃min，

8、循環(huán)次數(shù)為33。完成擴增后在瓊脂糖膠上電泳，置于凝膠成像儀上分析其灰度值。 結(jié)果：1.膿毒癥早期出現(xiàn)外周血促炎細胞因子濃度增高，提示體內(nèi)存在促炎細胞因子表達上調(diào)。在大鼠膿毒癥模型中，我們觀察到前促炎癥因子MIF在造模后2h即升高(P<0.05)，6h達到峰值；抗炎因子IL-10在造模后2h逐漸升高(P<0.05)，在12h時達到濃度峰值。2.對肝臟標本行常規(guī)病理切片觀察，觀察到在2h、6h、12h、24h時肝臟病變逐漸加重，提示

9、肝臟損傷隨著膿毒癥的進展而逐漸加重。3.對血清生化指標(ALT、TBIL)檢測發(fā)現(xiàn)大鼠ALT、TBIL隨著造模時間的延長而逐漸升高，提示肝臟損傷逐漸加重。4.CLP模型上可復制出膿毒癥的臨床及病理生理過程；從血清及組織炎性細胞因子的變化、器官功能損害和組織形態(tài)學損傷等不同的側(cè)面都證實了膿毒癥中促炎癥因子MIF與抗炎因子IL-10之間的相關(guān)性(MIFmRNA/ IL-10mRNA：r=0.807 P<0.05，MIF/IL-10：r=0.

10、655 P<0.05)，及與肝臟損傷密切相關(guān)(MIFmRNA/ALT：r=0.39 P<0.05，IL-10mRNA/ALT：r=0.545 P<0.05，MIF/ALT：r=0.49 P<0.05，IL-10/ALT： r=0.461 P<0.05，MIFmRNA/TBIL：r=0.596 P<0.05，IL-10mRNA/TBIL：r=0.553，P<0.05，MIF/TBIL：r=0.575，P<0.05，IL-10/TBIL：r