中藥對侵襲性真菌感染動物模型的調(diào)控及血液腫瘤患者真菌感染的DNA檢測.pdf

1、第一部分：侵襲性真菌感染動物模型的建立及中藥對侵襲性真菌感染動物模型的調(diào)控目的：深部真菌感染多為條件致病菌感染，在免疫力正常的人群中發(fā)病率并不高。近年來，由于大劑量的廣譜抗生素、免疫抑制劑和激素的廣泛使用甚至濫用，導(dǎo)致患者體內(nèi)菌群失調(diào)和機體免疫力下降，深部真菌感染極易發(fā)生。侵襲性真菌感染(IFI)已日益成為導(dǎo)致惡性血液病患者死亡的重要原因之一。目前臨床上抗真菌治療大多依賴西藥，其藥物毒性大、價格相對昂貴的缺點是顯而易見的。而國內(nèi)不乏優(yōu)良

2、的抗真菌中藥，但由于起步較晚，應(yīng)用有限，值得更進(jìn)一步的研究。本實驗旨在通過建立侵襲性真菌感染的動物模型，并應(yīng)用中藥對其進(jìn)行調(diào)控，來觀察和探討中藥抗真菌的療效和意義，為抗真菌中藥的廣泛應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。
　　 方法：選取清潔級雌性SD成年大鼠12只，隨機分為四組，分別為A組（免疫抑制+接種孢子+中藥治療組）4只，B組（免疫抑制+接種孢子+蒸餾水組）4只，C組（免疫抑制+未接種孢子組）2只，D組（正常對照組，未免疫抑制+未接種孢子）

3、2只。免疫抑制采用經(jīng)腹腔注射環(huán)磷酰胺的方法，接種孢子采用鼻腔滴入法，孢子為濃縮的煙曲霉菌孢子懸液(濃度為1*107)，中藥洽療采用灌胃法，從而建立真菌感染動物模型。實驗動物定期采血及處死，血液樣本行血清GM檢測（半乳糖甘露聚糖檢測），各組動物處死后取肺組織行HE染色及PAM染色（過碘酸六胺銀染色）制片鏡檢以查找真菌孢子或菌絲，部分肺組織行組織培養(yǎng)。
　　 1.GM檢測結(jié)果：以GM檢測i值>0.5為陽性判斷結(jié)果顯示免疫抑制+接種孢

4、子組(A+B組)GM檢測陽性率可達(dá)81.5％，其中A組檢測陽性率為：75％，B組GM檢測陽性率為86.7％，A、B兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，以GM檢測i值>0.7為陽性判斷結(jié)果顯示：A、B兩組GM檢測陽性率為：44.4％，其中A組檢測陽性率為：8.33％，B組GM檢測陽性率為73.3％，A組與B組陽性率比較差異顯著，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。C組均為陰性，D組除一個樣本陽性外余皆為陰性，考慮為污染造成的假陽性。A組G

5、M檢測值明顯低于B組，因樣本量較小，結(jié)果的統(tǒng)計學(xué)意義不明顯。
　　 2.動物模型肺組織病理學(xué)檢查：免疫抑制+接種孢子組（A+B組）：共8只大鼠，均可見不同程度的肺組織實變及炎性細(xì)胞浸潤，其中2只大鼠于接種后第7天行肺組織鏡檢在組織中發(fā)現(xiàn)曲霉菌菌絲，C組僅為免疫抑制組，肺組織切片染色后鏡檢可見肺組織炎性病理改變。D組為正常對照組，肺組織切片染色后鏡檢未發(fā)現(xiàn)明顯異常改變。
　　 3.肺組織培養(yǎng)：各組動物肺組織勻漿培養(yǎng)7天均未

6、發(fā)現(xiàn)曲霉菌生長。
　　 結(jié)論：1.該中藥方劑對大鼠真菌感染有一定治療作用。2.GM檢測可先于組織出現(xiàn)病灶之前發(fā)現(xiàn)真菌感染，可用于侵襲性真菌感染的早期診斷。
　　 第二部分：血液腫瘤患者真菌感染的DNA檢測目的：
　　 1.用實時熒光PCR方法檢測血液科發(fā)熱病人血清中的曲霉菌DNA含量，并與GM試驗和臨床表現(xiàn)相對比，探索其一致性和準(zhǔn)確性。
　　 2.評價實時熒光PCR法對侵襲性真菌感染的早期診斷價值。

7、>　　 方法：選取2008-2010年在山東省立醫(yī)院血液科住院的發(fā)熱病人的血清，行GM檢測，檢測陽性者利用Qiamp DNA MiNi Kit試劑盒提取病人血清樣本中的曲霉菌DNA，選取曲霉菌特異性引物，優(yōu)化實驗方法，設(shè)立陰性對照及標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立SYBR Green法Real-Time PCR的實驗室方法來定量檢測臨床發(fā)熱病人的曲霉菌感染，并與GM檢測方法作對比，探索其一致性和準(zhǔn)確性。
　　 結(jié)果：利用Qiamp

8、DNA MiNi Kit試劑盒所提取的曲霉菌DNA濃度和純度經(jīng)儀器測試后基本符合Real-Time PCR的實驗要求，建立的實時熒光PCR方法擴增曲線及熔解曲線形態(tài)不甚滿意，有大量非特異性擴增，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R2為0.97(＜0.99)，未能形成有效的標(biāo)準(zhǔn)曲線。PCR產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，樣品均無特異性擴增條帶，所設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)非特異性擴增條帶，擴增產(chǎn)物大小>500Bp，所有樣品均出現(xiàn)引物二聚體的擴增條帶，大小