核因子-kB介導(dǎo)小鼠ARDS中性粒細(xì)胞聚焦調(diào)控機(jī)制及PDTC干預(yù)作用研究.pdf

1、研究目的:
　　急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)本質(zhì)是過(guò)度失控的炎癥反應(yīng)，眾多效應(yīng)細(xì)胞參與ARDS進(jìn)程，而中性粒細(xì)胞(polymorphonuclear leukocyte，PMN)是最重要的效應(yīng)細(xì)胞。ARDS早期單核-巨噬細(xì)胞被激活，釋放腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1，I

2、L-1β)、IL-6、IL-8等促炎細(xì)胞因子，這些因子可激活PMN和內(nèi)皮細(xì)胞等效應(yīng)細(xì)胞，使大量PMN在肺內(nèi)聚集，釋放髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)、氧自由基及溶酶體酶等多種炎癥介質(zhì)，導(dǎo)致肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞的廣泛損傷。
　　核因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）是炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵性核轉(zhuǎn)錄因子，通常狀態(tài)下，NF-κB以二聚體形式與核因子-κB抑制蛋白(inhibit

3、orκB protein，IκB)結(jié)合形成NF-κB-IκB三聚體復(fù)合物，以非活性狀態(tài)存在于胞漿中。其中發(fā)揮主要生理功能的是NF-κBp50/p65二聚體，NF-κBp65為其主要亞單位。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革蘭氏陰性菌外膜主要成分，可使IκB激酶激活致NF-κB磷酸化，IκB解離，NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核與DNA特定的κB序列結(jié)合后活化，高效誘導(dǎo)抗炎-促炎細(xì)胞因子、粘附分子及趨化因子的基因轉(zhuǎn)錄。而TNF

4、-α、IL-1β也可激活NF-κB。IL-10是一種主要的抗炎細(xì)胞因子，對(duì)NF-κB的活化產(chǎn)生抑制作用，減少促炎細(xì)胞因子的表達(dá)。
　　粘附分子家族中與PMN活化關(guān)系最為密切的是整合素CD11b/CD18。在趨化因子的作用下，CD11b/CD18在PMN表面表達(dá)增多，并與其配體血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的細(xì)胞間粘附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)相互作用，參與PMN及血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘

5、附、跨越血管內(nèi)皮等病理生理過(guò)程。中性粒細(xì)胞趨化因子（cytokine induced neutrophil chemoattractant，CINC）是PMN特異性趨化因子，也是趨化因子IL-8家族的同源物。LPS、TNF-α及IL-1β的刺激可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞、肺間質(zhì)細(xì)胞等效應(yīng)細(xì)胞釋放CINC，對(duì)PMN向肺內(nèi)募集起重要作用。另一種趨化因子內(nèi)皮中性粒細(xì)胞激活肽-78(epithelial neutrophil activating pep-

6、tide-78，ENA-78)也可趨化PMN。此外，ENA-78與CD11b/CD18受體結(jié)合，會(huì)使內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)游離的Ca2+增加，致肺毛細(xì)血管通透性增加。
　　吡咯烷二硫代氨基甲酸(pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC)為一種抗氧化劑，是NF-κB的特異性抑制劑。PDTC通過(guò)穩(wěn)定抑制蛋白IκB、增加IκB的合成、阻止IκB的磷酸化和后續(xù)降解，抑制NF-κB激活，使細(xì)胞因子、粘附分子、趨化因子的表達(dá)減少，

7、抑制PMN等炎性細(xì)胞在肺內(nèi)的聚集。
　　本研究探討了小鼠ARDS時(shí)NF-κB活化、促炎-抗炎細(xì)胞因子表達(dá)與PMN肺內(nèi)聚集的關(guān)系;闡述肺組織粘附分子（CD11b/CD18、ICAM-1）及趨化因子（CINC、ENA-78）表達(dá)在PMN活化中的作用;研究PDTC對(duì)NF-κB的干預(yù)作用，為臨床治療ARDS提供新的思路。
　　研究方法:
　　一、動(dòng)物模型的建立及分組
　　腹腔內(nèi)注射LPS(20mg/kg)建立BALB/c

8、小鼠ARDS模型，隨機(jī)分對(duì)照組(N組)、脂多糖組（L組）、PDTC干預(yù)組（P+L組）。于LPS注射前半小時(shí)腹腔內(nèi)注射PDTC(120mg/kg)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)小鼠ARDS的干預(yù)。NS組腹腔內(nèi)注射20ml/kg的生理鹽水。
　　二、標(biāo)本的采集
　　每組小鼠于造模后2h、6h、12h及24h腹腔注射10％水合氯醛3.5ml/kg麻醉。因所測(cè)指標(biāo)無(wú)法一次取材成功，分三部分取材。第一部分:眼眶采血，取血清-80℃保存，備查細(xì)胞因子及總蛋白

9、。隨后開(kāi)胸，心尖采血行血?dú)夥治?留取肺組織，取右肺以備HE染色和免疫組化染色;取左肺計(jì)算肺濕/干重比值(wet/dry weight ratio，W/D)。第二部分:收集支氣管肺胞灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)，離心，取上清液行細(xì)胞因子及總蛋白水平測(cè)定，收集細(xì)胞沉渣，行白細(xì)胞計(jì)數(shù)及測(cè)PMN比例。第三部分:取肺組織放入-80℃液氮中保存，備Western blot、逆轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)定量PCR及髓過(guò)

10、氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)活性的檢測(cè)。
　　三、檢測(cè)方法及指標(biāo)
　　1、HE染色評(píng)估肺組織病理?yè)p傷及評(píng)分;測(cè)肺通透指數(shù)（lung permeability index，LPI=BALF中蛋白/血清蛋白）及W/D;測(cè)P(A-a)O2。
　　2、取BALF細(xì)胞沉渣，行Wright-Giemsa染色，計(jì)數(shù)白細(xì)胞總數(shù)及PMN的比例。
　　3、收集BALF上清液及取備用血清，ELISA法檢測(cè)TNF-

11、α、IL-1β、IL-8及IL-10的水平;應(yīng)用試劑盒檢測(cè)肺組織MPO活性。
　　4、提取肺組織總蛋白，Western blot法測(cè)定磷酸化NF-kB(phospho-nuclear fac-tor-kappa B，p-NF-κB)表達(dá);提取胞漿及胞核蛋白，Western blot法測(cè)定胞漿及胞核NF-kBp65表達(dá)。
　　5、免疫組化法檢測(cè)肺組織NF-kB、粘附分子（CD11b/CD18、ICAM-1）及趨化因子ENA-7

12、8表達(dá)。
　　6、采用逆轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)定量PCR(Real-timePCR)法測(cè)肺組織CINCmRNA表達(dá)強(qiáng)度。
　　7、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:所有數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件包分析。兩兩之間的比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01表明差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　研究結(jié)果:
　　一、一般情況
　　NS組小鼠呼吸平穩(wěn)，解剖后肺部外觀色澤粉紅;L組小鼠呼吸急促，口唇發(fā)紺，解剖

13、后肺體積增大，色澤暗紅或紫紅，臟層胸膜下點(diǎn)狀、片狀出血，切面淡紅色液體滲出;P+L組小鼠呼吸急促減輕，解剖后肺體積無(wú)明顯增大，色澤呈紅色，表面見(jiàn)少許散在的出血點(diǎn)，包膜張力減輕。
　　二、HE染色評(píng)估肺組織病理?yè)p傷及評(píng)分
　　1、HE染色
　　NS組肺組織結(jié)構(gòu)完整正常;L組部分肺泡壁不同程度的破壞或斷裂，肺微血管充血、出血、微血栓形成，肺泡腔及肺間質(zhì)內(nèi)見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞壞死;PDTC干預(yù)后肺組織損傷程度

14、減輕。
　　2、肺病理評(píng)分
　　L組肺組織病理評(píng)分明顯高于NS組(P＜0.01);PDTC干預(yù)后病理評(píng)分較L組下降(P＜0.05)，病理評(píng)分與HE染色肺組織損傷的動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)相似。
　　三、肺血管通透性變化的檢測(cè)
　　1、肺組織濕/干重比值(W/D)
　　L組肺組織W/D值較NS組明顯增加(P＜0.01)，隨著造模時(shí)間延長(zhǎng)W/D值逐漸增加;PDTC干預(yù)后肺水腫程度減輕，W/D值均較LS組明顯下降(P＜0.0

15、5)，但高于NS組。
　　2、肺通透指數(shù)(LPI)
　　L組肺LPI較NS組明顯升高(P＜0.01)，PDTC干預(yù)后肺泡腔及肺間質(zhì)內(nèi)蛋白滲出減少，與L組對(duì)比，LPI下降(P＜0.05)。
　　四、BALF中白細(xì)胞總數(shù)及PMN比例
　　L組白細(xì)胞總數(shù)及PMN比例較NS組進(jìn)行性增加(P＜0.01);PDTC干預(yù)后白細(xì)胞總數(shù)下降，各時(shí)相點(diǎn)均低于L組，2h及6h與L組對(duì)比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，12h及24h

16、與L組對(duì)比，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）;但P+L組各時(shí)相點(diǎn)PMN比例與L組對(duì)比呈下降趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　五、血清及BALF中TNF-α、IL-1β、IL-8及IL-10的表達(dá)
　　L組血清及BALF中TNF-α、IL-1β及IL-8的濃度明顯高于NS組（P＜0.01）;PDTC干預(yù)后TNF-α、IL-1β及IL-8的濃度在2h、6h及12h低于L組(P＜0.05)，而在24h明顯低于L組

17、，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），但均高于NS組。
　　與NS組對(duì)比，L組在最初6h內(nèi)血清及BALF中IL-10的濃度升高(P＜0.05)，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，IL-10的濃度明顯升高(P＜0.01);PDTC干預(yù)后，與L組比較，2hIL-10的濃度略降低，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但6h、12h及24hIL-10的濃度低于L組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　六、肺組織中MPO的活性
　　L組肺組織M

18、PO活性較NS組明顯增加（P＜0.01）;PDTC干預(yù)后與L組比較，MPO活性降低（P＜0.05），但不能回到正常水平。
　　七、Western blot檢測(cè)肺組織p-NF-κB、胞漿及胞核中NF-κBp65蛋白的表達(dá)
　　L組肺組織p-NF-κB蛋白的表達(dá)增強(qiáng)，與NS組相比(P＜0.01);PDTC干預(yù)后p-NF-κB蛋白的表達(dá)增強(qiáng)較L組降低(P＜0.05)。
　　L組肺組織胞漿中P65蛋白的表達(dá)強(qiáng)度降低，而胞核中P

19、65蛋白表達(dá)強(qiáng)度升高，與NS組比較(P＜0.01)。PDTC干預(yù)后胞漿中P65蛋白的表達(dá)強(qiáng)度較L組升高(P＜0.05);在2h、6h及12h而胞核中P65蛋白表達(dá)強(qiáng)度較L組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，在24h胞核中P65蛋白表達(dá)強(qiáng)度較L組明顯降低，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　八、逆轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)CINCmRNA的表達(dá)
　　NS組肺組織有極少量的CINCmRNA的表達(dá);與NS組相比，L組C

20、INCmRNA的表達(dá)明顯增加(P＜0.01);PDTC干預(yù)后肺組織CINCmRNA的表達(dá)與L組對(duì)比表達(dá)明顯減少(P＜0.01)。
　　九、免疫組化檢測(cè)肺組織NF-κB、CD11b/CD18及ICAM-1、ENA-78的表達(dá)
　　以細(xì)胞出現(xiàn)棕褐色或棕黃色著色為陽(yáng)性表達(dá)。與NS組對(duì)比，L組可見(jiàn)較多的NF-κB陽(yáng)性免疫反應(yīng)的細(xì)胞，主要表達(dá)在肺間質(zhì)PMN;PDTC干預(yù)后NF-κB陽(yáng)性免疫反應(yīng)的細(xì)胞減少。L組CD11b/CD18陽(yáng)性表

21、達(dá)的細(xì)胞較NS組明顯增加，主要在PMN上表達(dá);PDTC干預(yù)后CD11b/CD18陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞減少。ICAM-1主要表達(dá)在血管內(nèi)皮細(xì)胞，與NS組對(duì)比，L組ICAM-1陽(yáng)性免疫反應(yīng)的細(xì)胞增加;PDTC干預(yù)后ICAM-1陽(yáng)性免疫反應(yīng)的細(xì)胞減少。與NS組對(duì)比，L組ENA-78陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞增加，以內(nèi)皮細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)為主;PDTC干預(yù)后ENA-78陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞減少。
　　研究結(jié)論:
　　1、LPS誘導(dǎo)的ARDS中，NF-κB磷酸化降

22、解，NF-κBp65由胞漿向胞核轉(zhuǎn)移，NF-κB激活，細(xì)胞因子(IL-1β、IL-8、IL-10和TNF-α)、粘附分子及趨化因子表達(dá)增加。
　　2、小鼠ARDS早期促炎-抗炎反應(yīng)失衡，表現(xiàn)在促炎細(xì)胞因子表達(dá)增多，抗炎細(xì)胞因子相對(duì)不足，且高表達(dá)時(shí)間滯后。
　　3、在趨化因子(CINC、ENA-78)的作用下，PMN表面粘附分子CD11b/CD18表達(dá)增多，與其配體內(nèi)皮細(xì)胞表面的粘附分子ICAM-1相互作用，使PMN粘附在血管

23、壁，并跨越內(nèi)皮向肺組織浸潤(rùn)。
　　4、PDTC通過(guò)抑制NF-κB的激活，下調(diào)細(xì)胞因子、粘附分子及趨化因子的表達(dá)，減少PMN聚集，改善促炎-抗炎介質(zhì)的失衡，使PMN釋放的MPO減少，肺組織損傷減輕。
　　創(chuàng)新性及意義:
　　1、本研究系統(tǒng)地從肺組織p-NF-κB及胞漿、胞核p65蛋白表達(dá)闡述ADRS時(shí)NF-κB活化。
　　2、探討粘附分子、趨化因子的高表達(dá)對(duì)ARDS肺組織PMN聚集的影響。
　　3、研究NF-