基于γ-氨基丁酸A型受體的魚類受漁藥影響的研究.pdf

1、γ-氨基丁酸（Gama-Aminobutiric acid, GABA）是機體內(nèi)一種主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中分布。在體內(nèi)，谷氨酸在谷氨酸脫羧酶（Glutamatedecarboxylase，GAD）作用下，不可逆的脫去α位上的羧基形成GABA，生成的GABA在GABA轉(zhuǎn)氨酶（GABA transaminase, GABA-T）催化作用下生成琥珀酸半醛。其中GAD存在GAD65和GAD67兩種同工酶。
　　γ-氨基

2、丁酸受體（GABA receptor，GABAR）是指突觸膜上能識別和結(jié)合GABA的部位，當GABA與其結(jié)合后，細胞膜離子通透性發(fā)生改變，從而引起神經(jīng)發(fā)生抑制。GABAR根據(jù)對激動劑和抑制劑的敏感性不同分為GABAAR（ARs）、GABABR（BRs）和GABACR（CRs）三個亞型。GABAAR是由膜蛋白組成的五聚體，為離子通道型受體，其中α1β2γ2是ARs最主要的一種亞型，且每個α1β2γ2亞型中均含有2個α1和β2亞基。

3、　　目前，關(guān)于淡水魚類GABAAR以及漁藥對GABAAR的影響等研究還未見有相關(guān)報道。異育銀鯽為我國廣泛養(yǎng)殖的大宗淡水魚類之一；因此，本文以異育銀鯽為研究對象，采用RT-PCR、qPCR以及HPLC等方法研究了異育銀鯽體內(nèi)GABAAR、GABA合成代謝酶的組織分布特點，并進行了基于GABAA受體的魚類受阿維菌素及雙氟沙星影響的研究。
　　第一部分異育銀鯽體內(nèi)GABAA受體及其GABA相關(guān)合成代謝酶研究
　　以異育銀鯽為研究對

4、象，首先運用RT-PCR分析了GABAA受體β2亞基（ARβ2）的a、b亞型在異育銀鯽體內(nèi)的分布情況。結(jié)果顯示在異育銀鯽中樞神經(jīng)系統(tǒng)（端腦、中腦、小腦、延腦）和外周神經(jīng)組織（肝臟、腎臟、心臟、腸道、鰾、鰓、肌肉及鰭條）均有A型GABA受體β2亞基a、b亞型（ARβ2a和ARβ2b） mRNA表達；另外，GAD65、GAD67和GABA-T在上述組織中均有表達。
　　其次運用熒光定量PCR方法對異育銀鯽不同組織中ARβ2a、ARβ2

5、b、GAD和GABA-T基因mRNA的表達情況進行了定量研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)ARβ2a、 ARβ2b、GAD和GABA-T mRNA主要在大腦組織中表達，外周組織表達極少；但是GABA-T除了在大腦中大量表達之外，還在外周組織特別是肝臟組織中有相當一部分的GABA-T表達。另外，研究不同發(fā)育階段對受體表達的影響結(jié)果顯示，當異育銀鯽體重發(fā)生變化時，組織中的ARβ2a、ARβ2b的表達也發(fā)生了改變。
　　第二部分基于GABAA受體的異育銀鯽

6、受阿維菌素類藥物影響研究
　　阿維菌素（Avermectin，AVM）是水產(chǎn)養(yǎng)殖上廣泛使用的寄生蟲防治藥物之一。為了研究基于GABAA受體的阿維菌素類藥物對魚類的影響，本文首先測定了AVM對異育銀鯽急性毒性以及不同濃度下各組織中AVM殘留情況。結(jié)果顯示：AVM對體重為60.04±5.02 g的異育銀鯽24 h、48 h和96 h半數(shù)致死濃度（LC50）分別為0.127、0.071和0.039 mg/L，因此推算得到AVM安全濃度（

7、SC）為0.0039 mg/L。AVM組織殘留結(jié)果顯示，AVM按照24 h、48 h及96 h半數(shù)致死濃度（0.127、0.071、0.039 mg/L）及安全濃度（0.0039 mg/L）潑灑用藥后，均能從異育銀鯽大腦組織中檢測出有AVM殘留，且大腦中AVM殘留量與用藥濃度呈正相關(guān)，其中24 h LC50濃度下大腦中AVM含量最高為0.292±0.005μg/g。結(jié)果表明，在上述用藥濃度下，AVM均能滲透血腦屏障進入異育銀鯽大腦。

8、r>　　AVM用藥后對異育銀鯽ARβ2亞基影響結(jié)果顯示，AVM按照24 h LC50、48 h LC50、96 h LC50及安全濃度（0.127、0.071、0.039、0.0039 mg?L-1）潑灑用藥后，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的端腦、中腦、小腦、延腦四種組織中ARβ2a和ARβ2b mRNA在不同用藥濃度及不同時間點，均表現(xiàn)為極顯著下調(diào)，且延腦是ARβ2a和ARβ2b mRNA表達下調(diào)最為明顯的組織。而外周組織中，肝臟、腎臟組織中ARβ

9、2a mRNA表達顯著上調(diào)，而肌肉組織中ARβ2a mRNA顯著下調(diào)；而ARβ2b除腎臟組織在24h（96 h LC50）時間點上顯著上調(diào)之外，肝臟、腎臟、肌肉三種組織ARβ2b mRNA表達均表現(xiàn)為極顯著下調(diào)。且結(jié)果顯示，肝臟、腎臟、肌肉三種外周組織中ARβ2a和ARβ2b mRNA表達的上、下調(diào)幅度與AVM用藥濃度無關(guān)。上述結(jié)果表明AVM用藥后，異育銀鯽體內(nèi)ARβ2mRNA表達量呈下降趨勢。
　　另外，結(jié)果顯示AVM用藥后對異

10、育銀鯽GAD、GABA-T基因mRNA表達也產(chǎn)生了影響。GAD方面，AVM根據(jù)上述濃度潑灑用藥后，大腦組織中，端腦、中腦、小腦和延腦四種組織中的GAD65和GAD67 mRNA表達均表現(xiàn)為極顯著下調(diào)，且延腦是GAD65和GAD67 mRNA下調(diào)最為明顯的組織。而在外周組織中，除了24h（96h LC50）時間點上GAD65和GAD67 mRNA表達顯著上調(diào)之外，肝臟、腎臟、肌肉三種外周組織中的GAD65和GAD67 mRNA在不同用藥濃

11、度及不同時間點上均表現(xiàn)為極顯著下調(diào)，其中肌肉組織為GAD65和GAD67 mRNA表達下調(diào)最為顯著的外周組織。GABA-T方面，AVM在上述用藥濃度條件下，端腦、中腦、小腦延腦四種大腦組織中的GABA-T mRNA表達均顯著下調(diào)；外周組織中除了腎臟組織在24h（96 h LC50）時GABA-T mRNA表達顯著上調(diào)之外（1.32±0.07倍），其余均表現(xiàn)為極顯著下調(diào)。AVM用藥后對異育銀鯽GAD、GABA-T基因mRNA表達影響的結(jié)果

12、總體表明AVM用藥后，異育銀鯽體內(nèi)GABA的合成及代謝均是減緩的。
　　第三部分基于GABAA受體的異育銀鯽受氟喹諾酮類藥物影響研究
　　同樣，為了研究基于GABAA受體的異育銀鯽受氟喹諾酮類藥物的影響，本文首先測定了DIF（其中一種氟喹諾酮類藥物）對異育銀鯽急性毒性以及不同劑量條件下各組織中DIF組織殘留情況。結(jié)果顯示：DIF對體重為60.04±5.02 g的異育銀鯽在單次前腸投喂方式給藥條件下96 h半數(shù)致死劑量（LD5

13、0）為2840 mg/kg，根據(jù)漁藥毒性分級標準判斷其為低毒物質(zhì)。DIF組織殘留方面，異育銀鯽大腦組織在96 h LD50第96h時及臨床用藥劑量上限（20 mg/kg）的24個時間點上均能檢測出DIF的存在，說明DIF滲透通過異育銀鯽BBB而進入其大腦組織。另外，DIF采用臨床用藥劑量上限（20 mg/kg）給藥后，大腦、肝臟、腎臟及肌肉四種組織中以大腦組織中的藥物消除過程最為平緩；且到試驗第960 h，大腦組織中DIF含量最高（0.

14、392±0.007μg/g）。因此可以推測異育銀鯽大腦組織可以作為DIF藥物殘留分析的靶組織。
　　DIF用藥后對異育銀鯽ARβ2亞基影響方面，DIF在96 h LD50及20 mg/kg用藥條件下，端腦、中腦、小腦、延腦組織中的ARβ2a mRNA的表達均極顯著下調(diào)；對ARβ2b mRNA的表達除了延腦20 mg/kg用藥條件下表達下調(diào)之外，端腦、中腦、小腦中的表達均上調(diào)。其中端腦是魚類高級運動中樞，由此可以推測 DIF所引起的

15、神經(jīng)興奮可能是通過對ARβ2b mRNA的表達的上調(diào)實現(xiàn)的。外周組織中，肝臟、腎臟和肌肉中ARβ2a和ARβ2b mRNA表達均極顯著上調(diào)，其中以對肌肉組織中的表達影響最為明顯。上述結(jié)果表明DIF用藥后，異育銀鯽體內(nèi)ARβ2 mRNA表達量總體呈增加趨勢。
　　對異育銀鯽GAD基因影響方面，腦組織在DIF（96 h LD50）用藥條件下，端腦、中腦、小腦、延腦組織中GAD65和GAD67 mRNA的表達顯著上調(diào)或者極顯著上調(diào)；而2

16、0 mg/kg用藥下，DIF對GAD65和GAD67 mRNA的表達均下調(diào)。由此可以推論：在96 h LD50用藥條件下，大腦中的GABA的合成量是增加的，而在20 mg/kg用藥下各個時間點GABA的合成減少的。DIF對異育銀鯽GABA-T基因影響方面，在96 h LD50用藥條件下，端腦、中腦、小腦、延腦、肝臟、腎臟和肌肉組織中GABA-T mRNA的表達均極顯著上調(diào)。結(jié)果表明在96 h LD50 DIF用藥條件下，上述各組織中GA

17、BA的代謝是極顯著加強的。
　　綜上，研究發(fā)現(xiàn)ARβ2（a、b亞型）、GAD及GABA-T在異育銀鯽中樞神經(jīng)系統(tǒng)的端腦、中腦、小腦、延腦和外周神經(jīng)組織的肝臟、腎臟、心臟、腸道、鰾、鰓、肌肉及鰭條等12部位均有分布，且上述基因的表達均主要集中在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中?；贕ABAA受體的魚類受藥物影響結(jié)果表明，阿維菌素及雙氟沙星絕大多數(shù)情況下能對受體的下調(diào)表達影響。同樣AVM、DIF用藥后對異育銀鯽體內(nèi)GAD及GABA-T也能產(chǎn)生影響，但二