重慶地區(qū)門(mén)診兒童急性腹瀉相關(guān)病毒的流行特征與基因特征研究.pdf

1、背景：
　　急性腹瀉在嬰幼兒中具有很高的發(fā)病率(morbidity)和死亡率(mortality)，尤其是在發(fā)展中國(guó)家，每年有超過(guò)200萬(wàn)的兒童死于急性腹瀉。據(jù)報(bào)道世界范圍內(nèi)每年有超過(guò)7億五歲以下的兒童發(fā)生急性腹瀉。隨著手消毒技術(shù)的應(yīng)用和環(huán)境衛(wèi)生的改善，細(xì)菌和寄生蟲(chóng)導(dǎo)致的腹瀉逐漸減少。但因缺乏有效的治療措施，病毒相關(guān)腹瀉的控制并不是十分理想。諾如病毒(Norovirus，NoV)、輪狀病毒(Rotavirus，RV)、腺病毒(Ad

2、enovirus，ADV)、札如病毒(Sapovirus，SLV)和星狀病毒(Astrovirus，ASV)都是病毒性腹瀉常見(jiàn)的病原體。急性腹瀉已經(jīng)成為僅次于肺炎的兒童死亡的第二大原因，成為兒童的公共健康問(wèn)題。
　　目的：
　　掌握中國(guó)重慶地區(qū)兒童急性腹瀉感染病毒性病原體構(gòu)成譜及其流行特征，探討重點(diǎn)病原體——諾如病毒主要的流行毒株基因型、流行趨勢(shì)、及其基因變異進(jìn)化特征，并了解重慶地區(qū)是否存在新的諾如病毒重組株;了解腹瀉兒童感

3、染博卡病毒的型別及其流行特征。
　　方法：
　　2009年8月到2013年11月，以重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院為哨點(diǎn)醫(yī)院，開(kāi)展急性腹瀉病毒的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，按照統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)納入重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院門(mén)診部的急性腹瀉患者，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的腹瀉問(wèn)卷調(diào)查與門(mén)診信息收集，獲取病人的人口學(xué)信息和臨床癥狀。收集患者急性期的糞便標(biāo)本，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、Real-Time PCR和常規(guī)PCR等方法檢測(cè)8種常見(jiàn)腹瀉病毒: A組輪狀病毒(G

4、roupARotavirus，RVA)、B組輪狀病毒(Group B Rotavirus，RVB)、C組輪狀病毒(Group C Rotavirus，RVC)、諾如病毒Ⅰ型(Norovirus typeⅠ，GI)，諾如病毒Ⅱ型(Norovirus typeⅡ，GⅡ)、ADV、ASV和SLV。對(duì)諾如病毒檢測(cè)陽(yáng)性的標(biāo)本進(jìn)一步獲取ORF1和ORF2的目的基因片段序列。對(duì)基因序列進(jìn)行同源性分析和重組分析，將諾如病毒的基因序列上傳到www.Nor

5、onet.nl，利用自動(dòng)諾如病毒分型工具分別對(duì)ORF1和ORF2進(jìn)行基因分型，ORF1基因型與ORF2基因型不一致時(shí)提示重組株的存在。分別對(duì)諾如病毒的多聚酶區(qū)和衣殼蛋白區(qū)的核酸序列做進(jìn)化樹(shù)，并與Noronet分型結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，進(jìn)一步確定重組株的存在。對(duì)新的重組基因型分別利用RDP4和SimPlot進(jìn)行重組分析，確定重組位點(diǎn)。PCR擴(kuò)增博卡病毒，產(chǎn)物測(cè)序后在NCBI進(jìn)行序列比對(duì)，確定博卡病毒的基因型，并從GenBank下載國(guó)內(nèi)外HBoV的

6、標(biāo)準(zhǔn)株序列，使用Mega5.1建立進(jìn)化樹(shù)。
　　結(jié)果：
　　1.急性腹瀉病毒的病原譜及其流行特征
　　(1)研究期間共納入門(mén)診急性腹瀉患者2416例，腹瀉病毒的檢出率為70.58％。其中諾如病毒檢出率最高，為50.82％，其他依次為輪狀病38.82％，腺病毒4.63％，星狀病毒3.76％和札如病毒2.64％。其中586例患者發(fā)生復(fù)合感染，諾如病毒和輪狀病毒復(fù)合感染是最常見(jiàn)的復(fù)合感染類(lèi)型。
　　(2)諾如病毒檢測(cè)陽(yáng)

7、性率在7-12月的兒童最高(56.64％)，與小于6個(gè)月的兒童(44.21％)和大于2歲的兒童(45.62％)相比具有顯著性差異(卡方檢驗(yàn)，P＜0.0001)。7-24個(gè)月之間兒童輪狀病毒的檢出率，以及發(fā)生復(fù)合感染的概率高于小于6個(gè)月和大于2歲的兒童(輪狀病毒，P＜0.0001;復(fù)合感染:卡方檢驗(yàn)，P＜0.0001)。不同性別的腹瀉兒童的病毒陽(yáng)性檢出率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.4095)。
　　(3) GⅡ型諾如病毒和A組輪狀病毒的感

8、染流行均具有明顯的季節(jié)性。GⅡ型諾如病毒的陽(yáng)性檢出率在夏秋季（7-11月）為高峰，春季（3-5月）為低谷。RVA檢測(cè)陽(yáng)性率呈現(xiàn)雙峰分布，在秋季和冬季出現(xiàn)兩個(gè)流行高峰，在夏季的檢出率最低。2012年春季GⅡ型諾如病毒的檢出率存在異常的高峰，提示可能存在GⅡ型諾如病毒的暴發(fā)。
　　(4) GⅡ患者就診前腹瀉天數(shù)長(zhǎng)于RVA患者(3.61VS3.23，P=0.0118)，但是兩者就診前的平均腹瀉次數(shù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(5.89VS6.01，P=

9、0.5031);RVA感染患者發(fā)生嘔吐的概率高于GⅡ(56.69VS50.00，P=0.0220)。復(fù)合感染患者發(fā)生嘔吐的比例高于單一病毒感染(57.17％ VS50.08％，P=0.0064)。
　　2.諾如病毒的基因型分布及重組狀況
　　(1)不同年份流行的諾如病毒基因型存在較大的差異。2010年重慶地區(qū)的流行型別為GⅡ.42006b和GⅡ.4 New Orleans2009;2011年的流行株為GⅡ.12/GⅡ.3和G

10、Ⅱ.42006b;2012年9月份前，GⅡ.42006b是主要的流行株，10月份首次在重慶檢測(cè)到GⅡ.4 Sydney_2012，并迅速取代2006b成為重慶地區(qū)中最要的流行株;2013年GⅡ.4 Sydney_2012和GⅡ.12/GⅡ.3成為最重要的流行株，GⅡ.42006b不再流行。幾種主要流行株GⅡ.42006b、GⅡ.12/GⅡ.3、GⅡ.4 Sydney_2012的感染患者的年齡和性別構(gòu)成以及臨床癥狀均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

11、　　(2)重慶地區(qū)檢測(cè)到的散發(fā)諾如病毒基因型包括GⅡ.16/GⅡ.2、GⅡ.21/GⅡ.3、GⅡ.15/GⅡ.15、GⅡ.6/GⅡ.6和GⅡ.16/GⅡ.13。其中GⅡ.16/GⅡ.13重組株為首次在中國(guó)地區(qū)檢測(cè)到。SimPlot重組分析和RDP.4重組分析都證實(shí)GⅡ.16/GⅡ.13重組株的存在。重慶GⅡ.16/GⅡ.13與2012年引起德國(guó)Berlin、Luckenwalde和Oranienburg等城市大規(guī)模的急性胃腸炎暴發(fā)的Be

12、rlin1195/2012/DE(KC832472)同源性高達(dá)99％，但其在重慶地區(qū)只引起少量的散發(fā)病例。
　　3.博卡病毒的基因型分布及重組狀況
　　(1)2011年共收集腹瀉標(biāo)本504份，共有49份樣本為HBoV陽(yáng)性，檢出陽(yáng)性率為9.72％。男性兒童陽(yáng)性31例，檢出率為10.20％;女性兒童18例，檢出率為9.00％。不同性別的患兒之間HBoV的檢出率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.759)。不同年齡段之間的HBoV的檢出率無(wú)統(tǒng)計(jì)

13、學(xué)差異(P=0.280)。HBoV分布具有季節(jié)性，在2月份和7～8月份存在兩個(gè)檢出率的高峰(P=0.002)。
　　(2)根據(jù)BLAST比對(duì)和NS1核酸序列進(jìn)化樹(shù)的結(jié)果，將檢測(cè)到的HBoV分為3型，25株(51.02％)為HBoV1，23(46.94％)株為HBoV2，1株(2.04)為HBoV3，其檢出率分別為4.96％，4.56％和0.20％。重慶地區(qū)腹瀉樣本中HBoV病毒NS1序列的同源性為79.9～100％，HBoV1組內(nèi)

14、的同源性為98.8～100％，HBoV2組內(nèi)的同源性為99.3～100％。重慶地區(qū)腹瀉HBov1與呼吸道的HBoV1有很高的同源性(98-100％)。HBoV2主要為HBoV-2B型，與FJ375129/Shanghai和FJ973559/Nigeria在進(jìn)化樹(shù)上有很高的同源性，與EU082213/USA同源性較遠(yuǎn)。腹瀉樣本1031病毒株與HBoV3病毒株JN086998/USA的同源性高達(dá)100％。
　　結(jié)論:
　　1.急

15、性腹瀉病毒的病原譜及其流行特征
　　門(mén)診兒童急性腹瀉患者大多由病毒引起，其中GⅡ型諾如病毒和A組輪狀病毒是引起門(mén)診兒童腹瀉的主要病原體，其他依次為ADV、ASV和SLV。7-24個(gè)月為GⅡ和RVA告高發(fā)年齡段兒童。GⅡ和RVA的感染流行均具有明顯的季節(jié)性，但兩種病毒的主要流行季節(jié)并不相同。GⅡ的病毒陽(yáng)性檢出率在夏秋季為高峰。而RVA在秋季和冬季出現(xiàn)兩個(gè)流行高峰。門(mén)診兒童患者GⅡ的住院前就診天數(shù)長(zhǎng)于RVA，RVA并發(fā)嘔吐概率高于GⅡ

16、。復(fù)合感染患者發(fā)生嘔吐的比例顯著高于單一病毒感染患者。
　　2.諾如病毒的基因型分布及重組狀況
　　(1)不同年份流行的諾如病毒基因型不同。到2013年GⅡ.12/GⅡ.3和GⅡ.4Sydney_2012已經(jīng)取代GⅡ.42006b和GⅡ.4 New Orleans2009成為重要的流行株。研究發(fā)現(xiàn)重慶的諾如病毒流行基因型的與時(shí)間密切相關(guān)，而且非常具有典型性。一方面，世界范圍的的流行株GⅡ.42006b和GⅡ.4 New Or

17、leans2009在重慶地區(qū)的流行與消失，以及最新的世界范圍的流行株GⅡ.4 Sydney_2012在重慶的出現(xiàn)并流行的時(shí)間與世界其他地方基本吻合。另一方面，具有地域性的，主要在亞太地區(qū)流行的GⅡ.12/GⅡ.3于2012-2013年在重慶地區(qū)也有很高的檢出率。
　　(2)重慶地區(qū)檢測(cè)到的散發(fā)諾如病毒基因型包括GⅡ.16/GⅡ.2、GⅡ.21/GⅡ.3、GⅡ.15/GⅡ.15、GⅡ.6/GⅡ.6和GⅡ.16/GⅡ.13。其中GⅡ.

18、16/GⅡ.13重組株為首次在中國(guó)地區(qū)檢測(cè)到。SimPlot重組分析和RPD.4分析結(jié)果都證實(shí)重組株的存在。
　　(3)2013年GⅡ.42006b消失后，我們?cè)谥貞c檢測(cè)到的流行病毒株和散發(fā)病毒株都為不同ORF1/ORF2基因型的重組株。重慶地區(qū)諾如病毒的流行模式作為一個(gè)實(shí)例說(shuō)明了諾如病毒重組，特別是ORF1/ORF2重疊區(qū)的重組對(duì)于諾如病毒進(jìn)化的重要意義。
　　3.博卡病毒的基因型分布及重組狀況
　　對(duì)重慶地區(qū)急性腹