布魯氏菌蛋白芯片的研制及抗體譜分析.pdf

1、布魯氏菌病是一種危害嚴(yán)重的人獸共患傳染病。布魯氏菌是布魯氏菌病的病原體，是一種胞內(nèi)寄生菌。布魯氏菌病的疫苗免疫和準(zhǔn)確診斷在布魯氏菌病的預(yù)防和控制中起重要作用，但現(xiàn)有的布魯氏菌診斷和疫苗的研究都圍繞在少數(shù)幾個(gè)抗原上，因此，研究進(jìn)展緩慢。根據(jù)布魯氏菌的特點(diǎn)，布魯氏菌中應(yīng)該還有更多的抗原，可能作為布魯氏菌的診斷和疫苗研究的靶標(biāo)。能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)和抗體的蛋白很多都是外膜蛋白、分泌蛋白和毒力相關(guān)蛋白，因此，從這些蛋白中尋找具有診斷和疫苗研

2、究的候選抗原已成為病原菌研究的重要內(nèi)容?；蚪M學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的研究成果，更促進(jìn)了這類蛋白的研究，也產(chǎn)生了一個(gè)新的研究策略，即根據(jù)基因組序列和蛋白質(zhì)組成的分析，在較小的目標(biāo)范圍內(nèi)尋找候選蛋白。本研究中，我們結(jié)合前期布魯氏菌外膜蛋白質(zhì)組和分泌蛋白質(zhì)組的研究結(jié)果，以及文獻(xiàn)報(bào)道的毒力相關(guān)蛋白的研究成果，依據(jù)一定原則，從這些蛋白中挑取蛋白，然后在體外進(jìn)行克隆表達(dá)，并利用蛋白芯片抗體譜方法分析蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體的規(guī)律，尋找可能作為診斷和疫苗研究的候選

3、靶標(biāo)蛋白。
　　 根據(jù)診斷抗原和保護(hù)性抗原的特征，將外膜和分泌蛋白作為研究的重點(diǎn)。根據(jù)布魯氏菌的分泌蛋白質(zhì)組和外膜蛋白質(zhì)組，從中篩選出91個(gè)外膜蛋白和分泌蛋白。查閱整理已有的毒力相關(guān)基因篩選的研究，從中挑取與布魯氏菌毒力相關(guān)的基因64個(gè)。鞭毛蛋白是重要抗原蛋白，布魯氏菌沒有明顯的鞭毛結(jié)構(gòu)，沒有運(yùn)動(dòng)性，但是在布魯氏菌中還存在鞭毛編碼基因，因此本研究選取了29個(gè)鞭毛基因。綜合前期已克隆表達(dá)的一些已知的抗原，共計(jì)207個(gè)蛋白作為本研究

4、的候選抗原進(jìn)行體外克隆表達(dá)及抗原性分析。
　　 根據(jù)挑取出來的蛋白基因，設(shè)計(jì)特異的PCR擴(kuò)增引物，在上下游引物的5'端分別添加GatewayBP反應(yīng)的attB重組位點(diǎn)的接頭序列，以及添加接頭的通用引物attB1和attB2。以16M的基因組為模板，進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增，其中第一輪是以特異引物進(jìn)行擴(kuò)增，第二輪是以第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物為模板進(jìn)行擴(kuò)增，添加重組位點(diǎn)序列。經(jīng)兩輪擴(kuò)增，207個(gè)基因中有176個(gè)能夠成功擴(kuò)增出預(yù)期大小的產(chǎn)物。PCR產(chǎn)

5、物純化后通過BP反應(yīng)構(gòu)建入門克隆，獲得156個(gè)基因的入門克隆，通過DNA測(cè)序?qū)θ腴T克隆的序列進(jìn)行了確認(rèn)。通過比較分析4個(gè)布魯氏菌蛋白在3個(gè)不同表達(dá)載體中表達(dá)的分析，對(duì)適合布魯氏菌蛋白表達(dá)的載體進(jìn)行篩選，確定pHXGWA作為布魯氏菌蛋白表達(dá)的載體。提取入門克隆質(zhì)粒，通過LR反應(yīng)將基因序列重組到表達(dá)載體，構(gòu)建了表達(dá)克隆，蛋白誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果顯示，共有123個(gè)蛋白能夠成功表達(dá)。
　　 構(gòu)建好各基因的表達(dá)載體并確定能夠表達(dá)之后，對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)的

6、條件，包括誘導(dǎo)劑的濃度、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間等進(jìn)行了優(yōu)化和確立，并對(duì)各個(gè)蛋白的表達(dá)形式進(jìn)行了分析，根據(jù)每個(gè)蛋白可溶性表達(dá)和包涵體表達(dá)的形式和表達(dá)量，采取相對(duì)應(yīng)的純化方法進(jìn)行了純化，最終獲得了全部123個(gè)蛋白的純化蛋白。
　　 將純化的蛋白以及不同種屬來源的IgG按一定布局點(diǎn)制在醛基修飾的玻片，研制成布魯氏菌的蛋白芯片，通過對(duì)封閉液、一抗?jié)舛?、二抗?jié)舛鹊冗M(jìn)行摸索，確定了蛋白芯片的反應(yīng)條件，然后對(duì)不同方式免疫的兔血清、免疫小鼠血清和自