蛋白芯片法在檢測(cè)念珠菌、曲霉優(yōu)勢(shì)抗體中的應(yīng)用.pdf

1、隨著器官、骨髓和干細(xì)胞移植的大量開(kāi)展，惡性腫瘤病人發(fā)病人數(shù)增加和生存期延長(zhǎng)導(dǎo)致免疫功能低下患者的數(shù)量不斷增加，廣譜抗菌藥物、免疫抑制劑等的廣泛使用，導(dǎo)管留置操作的普及，以及因嚴(yán)重疾病和大手術(shù)住在重癥監(jiān)護(hù)病房時(shí)間延長(zhǎng)，使得侵襲性真菌感染(Invasivefungalinfections，IFI)的發(fā)病率不斷升高。由于缺乏特異性臨床特征，血液真菌分離培養(yǎng)敏感性很低，IFI的病原學(xué)診斷十分困難。因此，迫切需要研究建立快速、簡(jiǎn)便，敏感性強(qiáng)、特異

2、性高的非培養(yǎng)診斷方法來(lái)改善侵襲性真菌感染的病原學(xué)診斷。
　　 研究目的：
　　 利用本實(shí)驗(yàn)室前期研究中篩選并制備的與念珠菌和曲霉侵襲性感染相關(guān)的三種重組蛋白，建立低密度蛋白質(zhì)芯片法，檢測(cè)臨床病人血清標(biāo)本中相應(yīng)的特異性抗體;評(píng)估該方法對(duì)侵襲性念珠菌病(IC)和侵襲性曲霉病（IA）診斷價(jià)值。
　　 研究方法：
　　 純化白念珠菌烯醇化酶(Eno)、果糖二磷酸醛縮酶(Fba1)和煙曲霉硫氧還蛋白還原酶(TR)三

3、種重組蛋白。分別對(duì)點(diǎn)樣緩沖液、抗原固定條件和封閉方式進(jìn)行優(yōu)化;同時(shí)對(duì)Eno，F(xiàn)ba1和TR三種真菌抗原的點(diǎn)陣濃度和待測(cè)血清稀釋度進(jìn)行優(yōu)化，確定其最佳的反應(yīng)條件。建立檢測(cè)念珠菌、曲霉優(yōu)勢(shì)抗體的蛋白芯片，并對(duì)該方法的特異性、重復(fù)性和穩(wěn)定性等方面進(jìn)行考察。收集各類(lèi)IC患者及IA患者血清，以定植感染者、細(xì)菌血癥患者、其他真菌感染者及健康體檢者血清為對(duì)照，用蛋白芯片法測(cè)定血清中的相應(yīng)抗體，確定cut-off值，評(píng)估該法在侵襲性念珠菌病(IC)和侵

4、襲性曲霉病(IA)診斷中的應(yīng)用價(jià)值。
　　 研究結(jié)果：
　　 (1)以硝酸纖維素膜為固相載體，對(duì)點(diǎn)樣緩沖液、抗原固定條件和封閉方式進(jìn)行優(yōu)化，確定以Tris-HC(l)緩沖液(pH8.5)為點(diǎn)樣緩沖液、37℃濕盒孵育2h、5％脫脂奶粉封閉1h為最佳反應(yīng)條件。在此基礎(chǔ)上對(duì)Eno，F(xiàn)ba1和TR三種真菌抗原的點(diǎn)陣濃度和血清稀釋度進(jìn)行優(yōu)化，最后確定:Eno、Fba1、TR點(diǎn)樣濃度依次為0.5mg/mL、0.04mg/mL、1.0

5、mg/mL，待測(cè)血清稀釋度為1∶10。
　　 (2)在研究結(jié)果(1)的基礎(chǔ)上，建立檢測(cè)念珠菌、曲霉優(yōu)勢(shì)抗體的蛋白芯片，對(duì)其進(jìn)行方法學(xué)考核，結(jié)果顯示該方法特異性及重復(fù)性良好，將該芯片置于4℃保存，75d內(nèi)用于檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果未見(jiàn)明顯變化。
　　 (3)以建立的蛋白芯片法測(cè)定IC、IA患者血清中的相應(yīng)抗體，以66.5、29.5、58.5作為抗Eno、抗Fba1、抗TR的cut-off值，結(jié)果抗Eno抗體和抗Fba1抗體對(duì)診斷I

6、C的敏感性和特異性分別為67.6％(71/105)和96.5％(299/310),64.8％(68/105)和90.3％(280/310)。通過(guò)聯(lián)合檢測(cè)抗Eno抗體和抗Fba1抗體，可將敏感性提高至81％?？筎R抗體對(duì)診斷IA的敏感性為71.4％(31/42)，特異性為98.2％(5/285)。
　　 結(jié)論：
　　 成功制備了檢測(cè)念珠菌、曲霉優(yōu)勢(shì)抗體的蛋白芯片，在此基礎(chǔ)上建立了檢測(cè)患者血清中抗Eno抗體、抗Fba1抗體及