建立同時檢測三種真菌毒素膜免疫芯片方法的研究與抗慶大霉素多克隆抗體的制備.pdf

1、本文主要從以下幾個方面展開：
　　 1、建立同時檢測三種真菌毒素膜免疫芯片方法的研究
　　 真菌毒素(Mycotoxin)是由真菌產(chǎn)生的有毒次級代謝產(chǎn)物,主要污染糧食及飼料等,一旦通過食物鏈進入人體后,將可能造成致癌、致畸和致突變等嚴重危害。目前比較常見的檢測方法有薄層層析法、高效液相色譜法和ELSIA等。膜免疫芯片技術(shù)是指將抗原或抗體固定于膜載體上的蛋白質(zhì)芯片技術(shù),不僅簡單快速、可同時檢測多種物質(zhì),而且結(jié)果易于判讀,特

2、別適合于大量樣本的現(xiàn)場檢測。在本實驗室已制備出黃曲霉毒素B1(Aflatoxin B1,AFB1)、赭曲霉毒素A(Ochratoxin A,OTA)和玉米赤霉烯酮(Zearelenone,ZEN)三種真菌毒素檢測抗原及其相應(yīng)單克隆抗體的基礎(chǔ)上,本研究通過將抗原固定于膜載體,根據(jù)間接競爭免疫學原理,建立了可同時并能定性檢測三種真菌毒素的膜免疫芯片方法。結(jié)果如下:
　　 (1)AFB1、OTA和ZEN膜免疫檢測方法的研究
　　

3、 以PVDF膜為固相載體,采用一種新型的、簡單的點樣方法,對點樣緩沖液、抗原固定條件和封閉方式分別進行了優(yōu)化,確定了以Tris-HCl緩沖液(含10％甘油和0.1％海藻糖,pH8.5)為點樣緩沖液、37℃濕盒孵育2 h、5％脫脂牛奶封閉1 h為最佳反應(yīng)條件,在此基礎(chǔ)之上確定了:AFB1檢測抗原點陣濃度為125μg/mL、抗AFB1單克隆抗體濃度為1/2000時,AFB1檢測閾值為2.0ng/mL；OTA檢測抗原點陣濃度為10μg/mL

4、、抗OTA單克隆抗體濃度為1/5000時,OTA檢測閾值為2.0 ng/mL；ZEN檢測抗原點陣濃度為40μg/mL、抗ZEN單克隆抗體濃度為1/5000時,ZEN檢測閾值為3.0ng/mL。
　　 (2)同時檢測AFB1、OTA和ZEN膜免疫芯片方法的建立
　　 在研究結(jié)果(1)的基礎(chǔ)上,建立了同時檢測AFB1、OTA和ZEN膜免疫芯片的方法,該方法對AFB1/OTA/ZEN三種真菌毒素的檢測閾值為2.0/2.0/3.

5、0ng/mL,20％的甲醇濃度對檢測結(jié)果未見有明顯影響。同時,研究了膜免疫芯片的特異性、重復性和穩(wěn)定性等,該方法制備的膜免疫芯片與脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和伏馬菌素B1無明顯交叉反應(yīng),批內(nèi)和批間重復均未見檢測閾值改變,膜免疫芯片于4℃保存90后用于檢測,檢測結(jié)果未見明顯變化。
　　 (3)實際樣品檢測
　　 用本研究所制備的膜芯片對12份玉米樣品進行檢測,肉眼判讀結(jié)果,檢出3份AFB1陽性超標樣品和4份ZEN陽性超標樣品,其中

6、AFB1和ZEN同時超標的樣品有2份,未檢出OTA陽性超標樣品。其結(jié)果與三種真菌毒素商品化ELISA試劑盒檢測結(jié)果一致。
　　 2、抗慶大霉素多克隆抗體的制備
　　 氨基糖苷類抗生素是一類應(yīng)用廣泛的廣譜抗菌藥物,主要包括慶大霉素(Gentamicin,GM)、鏈霉素和卡那霉素等,常用作獸醫(yī)臨床治療及飼料添加劑,不規(guī)范用藥會引起畜產(chǎn)品、尤其是牛奶中的藥物殘留,對人類的健康構(gòu)成危害。因此,對該類藥物進行及時檢測是預(yù)防和控制其

7、危害的有效手段。本研究進行了抗慶大霉素多克隆抗體的制備研究,旨在建立抗慶大霉素的免疫學檢測方法。
　　 結(jié)果：如下:
　　 采用碳化亞胺(EDC)法合成慶大霉素的免疫抗原(GM-BSA),用戊二醛法合成慶大霉素的檢測抗原(GM-GA-OVA),經(jīng)SDS-PAGE初步鑒定兩種抗原合成成功。用免疫抗原GM-BSA免疫9只Balb/C小鼠,經(jīng)四次加強免疫后,間接ELISA檢測發(fā)現(xiàn),9只老鼠的血清均產(chǎn)生了較高的效價,最高可達1: