MBL阻遏人MD-DC捕獲和呈遞HCMV的研究.pdf

1、研究背景：
　　 本研究純化天然MBL，研制和純化重組人野生型MBL，從人外周血單個(gè)核細(xì)胞衍生出DC；研究hMBL/rrhMBL阻遏HCMV感染MD-DC，和阻遏MD-DC將捕獲的HCMV呈遞給T細(xì)胞的功能，并初步探討其機(jī)制。為明確MBL阻斷HCMV感染的作用和機(jī)制，為MBL應(yīng)用于HCMV感染的治療與預(yù)防奠定基礎(chǔ)。
　　 材料與方法：
　　 1.建立rhMBL的CHO細(xì)胞株構(gòu)建rhMBL的PIRES2-AcGFP

2、表達(dá)載體，參照Ohtaniet al方法并加以改進(jìn)。用上述載體轉(zhuǎn)染中國(guó)倉鼠卵巢細(xì)胞株，按Transfast說明書配制轉(zhuǎn)染試劑并進(jìn)行轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的CHO細(xì)胞，用G418篩選抗性細(xì)胞即穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，RT-PCR分析穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株MBL基因的表達(dá)，ELISA檢測(cè)MBL蛋白。
　　 2.hMBL/rhMBL的獲得、純化、鑒定和定量CHO/MBL細(xì)胞在含20％小牛血清的MEDM培養(yǎng)液中，37℃，5％CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)。取培養(yǎng)上清和人

3、新鮮血漿進(jìn)行甘露聚糖-Sepharose4B親和層析純化。SDS-PAGE鑒定純度，考馬斯量藍(lán)進(jìn)行蛋白定量。
　　 3.MD-DC和T細(xì)胞培養(yǎng)通過淋巴細(xì)胞分離液分離濃縮外周血單個(gè)核細(xì)胞，貼壁2小時(shí)后除去未貼壁的細(xì)胞。在rhGM-CSF和rhIL-4含10％小牛血清的RPMI1640中培養(yǎng)。第3天半量換液，收集培養(yǎng)6天處于未成熟狀態(tài)的MD-DC，參考Svane IM報(bào)道方法，經(jīng)倒置相差顯微鏡觀察形態(tài)和流式檢測(cè)DC-SIGN分子表達(dá)

4、率；5μg/ml植物凝集素A(PHA)刺激人外周血單個(gè)核細(xì)胞，衍生為人活化T細(xì)胞。
　　 4.免疫熒光共聚焦顯微鏡觀察MBL阻滯MD-DC捕獲HCMV功能用PKH26標(biāo)記HCMV，洗滌4次除去未結(jié)合的PKH26，取2×107染色后的HCMV感染與MBL孵育半小時(shí)后的5×105MD-DC，反應(yīng)終體積為1ml，PBS洗滌4次除去未結(jié)合的HCMV，用CD209-FITC標(biāo)記MD-DC表面DC-SIGN分子。對(duì)照組的MD-DC未經(jīng)MBL

5、孵育。離心取沉淀做成載薄片。采用免疫熒光共聚焦顯微鏡觀察MBL處理前后DC-SIGN對(duì)HCMV的捕獲情況，并拍照。
　　 5.MBL阻遏MD-DC捕獲HCMV功能在48孔板中，每試驗(yàn)孔加5×105MD-DC，分別加hMBL/rhMBL到終濃度1μg/ml，5μg/ml，10μg/ml，加完全培養(yǎng)基在37℃，5％C02孵箱中孵育半小時(shí)。
　　 6.MD-DC呈遞HCMV給T細(xì)胞的功能在48孔板中，取MD-DC(2.5x10

6、5)加入HCMV（2×107DNA拷貝數(shù)），孵育半小時(shí)后，4次PBS沖洗，除去未結(jié)合的HCMV，與加入PHA刺激活化后的2.5×105T細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基在37℃，5％C02孵箱中培養(yǎng)，分別于第3天、4天取培養(yǎng)上清用RT-PCR檢測(cè)HCMV的DNA的量，每孔做5個(gè)復(fù)孔，每孔終體積為1ml，對(duì)照組不加T細(xì)胞。
　　 7.MBL阻遏MD-DC呈遞HCMV給T細(xì)胞的功能在48孔板中，經(jīng)方法5處理的MD-DC(2.5×105)與加入PH

7、A刺激活化后的2.5×105T細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基在37℃，5％C02孵箱中培養(yǎng)，分別于第3天、4天取上清用RT-PCR檢測(cè)HCMV的DNA的量，每孔做5個(gè)復(fù)孔，每孔終體積為1ml，對(duì)照組不加MBL。
　　 8.采用CD4+免疫磁株分選法分離出CD4+T細(xì)胞，按試劑盒操作說明進(jìn)行。
　　 9.CD209單抗和CD206單抗阻滯MD-DC呈遞HCMV功能試驗(yàn)。
　　 取新收獲的克隆增長(zhǎng)的MD-DC和PHA刺激活化的T

8、細(xì)胞，在含10％胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)液中，37℃，5％C0?及飽和濕度條件下培養(yǎng)，取存活率達(dá)95％以上的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。試驗(yàn)在48孔板中進(jìn)行，取MD-DC(2.5×108/每孔)分別與未被熒光標(biāo)記的10μg CD209單抗和10μg CD206單抗【抗甘露聚糖受體(mannan receptor MR)抗體】在37℃孵育15分鐘。加入HCMV（2×108DNA拷貝數(shù)/每孔），37℃孵育2小時(shí)后，4次PBS沖洗，除去未結(jié)合的HCMV

9、，與PHA刺激活化后的2.5×105T細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基在37℃，5％C02孵箱中共同培養(yǎng)，每孔終體積為1ml，每組做5個(gè)復(fù)孔，對(duì)照組不加抗體。試驗(yàn)分以下3組：
　　 (1)HCMV組（對(duì)照組）：MD-DC+HCMV+T細(xì)胞
　　 (2)CD206組：MD-DC+CD206+HCMV+T細(xì)胞
　　 (3)CD209組：MD-DC+CD209+HCMV+T細(xì)胞
　　 分別于第3天、4天取培養(yǎng)上清用RT-PC

10、R檢測(cè)HCMV的DNA的量；培養(yǎng)上清中HCMV DNA量的百分?jǐn)?shù)(％)=培養(yǎng)上清中HCMV DNA量/初始加入的HCMV DNA量(2×107)×100。
　　 10.PP65+GAM-FITC單色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)HCMV-PP65的量，參照試劑盒說明書進(jìn)行。
　　 11.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理全部數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。數(shù)據(jù)以均值士標(biāo)準(zhǔn)差(X±SD)表示，采用單向方差分析，P≤0.05有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　

11、　 結(jié)果：
　　 1.通過RT-Q-PCR技術(shù)檢測(cè)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞目的基因表達(dá)效果基因的表達(dá)量F=2的-△△ct次方
　　 △△ct=（待測(cè)樣品的目的基因的ct的平均—待測(cè)樣本的看家基因的ct的平均）-（對(duì)照樣品的目的基因的ct的平均—對(duì)照樣本的看家基因的ct的平均），備注：2-△△ct值越大，說明該基因的表達(dá)量越高；
　　 2.獲得大量高純度的hMBL/rhMBL
　　 從200ml人血漿中純化出320mg高

12、純度的MBL，在1000ml的CHO/MBL培養(yǎng)上清中，能純化到510mg，經(jīng)SDS-PAGE鑒定，經(jīng)SDS還原后的MBL單體的分子量為26KD，MBL經(jīng)SDS還原成單體跑膠未見明顯的雜蛋白條帶，提示純度高。
　　 3.MD-DC和活化T細(xì)胞的培養(yǎng)
　　 外周血單個(gè)核細(xì)胞GM-CSF和IL-4刺激后，第6天用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)：可見細(xì)胞集落樣生長(zhǎng)，折光性強(qiáng)，細(xì)胞不規(guī)則，有偽足。用CD209-FITC單色流式細(xì)胞儀

13、檢測(cè)MD-DC百分?jǐn)?shù)穩(wěn)定表達(dá)在85％以上。
　　 4.免疫熒光共聚焦顯微鏡觀察MBL阻滯MD-DC捕獲MCV的功能
　　 MD-DC捕獲了經(jīng)PKH26標(biāo)記的HCMV感染后，用CD209-FITC標(biāo)記MD-DC表面的DC-SIGN分子，然后采用免疫熒光共聚焦顯微鏡觀察MBL處理前后DC-SIGN對(duì)HCMV的捕獲情況?？梢娢唇?jīng)MBL孵育的MD-DC捕獲HCMV的量較多，而經(jīng)hMBL和rhMBL孵育后的MD-DC捕獲的HCMV

14、的量明顯減少。表明1Oμg/ml濃度的hMBL/rhMBL具有明顯的阻遏作用。
　　 5.hMBL/rhMBL阻遏MD-DC捕獲HCMV功能
　　 為探索MBL阻遏MD-DC捕獲HCMV的功能，MD-DC暴露于不同濃度和不同類型的MBL孵育半小時(shí)后，再與HCMV37℃孵育2小時(shí)后，MD-DC經(jīng)4次PBS洗滌徹底除去未被捕獲的HCMV，熒光定量PCR檢測(cè)MD-DC內(nèi)的HCMVDNA的拷貝數(shù)。這代表了被MD-DC捕獲的HCM

15、V DNA的量。與初始加入的HCMV DNA量為對(duì)照，捕獲的HCMV DNA量的百分?jǐn)?shù)(％)=捕獲的HCMVDNA量/初始加入的HCMV DNA量×100。與未經(jīng)MBL孵育過的MD-DC所捕獲的HCMV DNA量對(duì)照，捕獲的HCMV DNA量的百分?jǐn)?shù)(％)=MBL孵育后MD-DC捕獲的HCMV DNA量/未經(jīng)MBL孵育的MD-DC捕獲的HCMV DNA量×100。
　　 6.MD-DC呈遞HCMV給T細(xì)胞的功能
　　 結(jié)

16、果表明，第3天和第4天試驗(yàn)組“MD-DC+HCMV+T”組培養(yǎng)上清中HCMV DNA的量較對(duì)照組“MD-DC+HCMV”組明顯升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=46.398，P=-0.000；F=16.702，P=0.004）。提示有大量的HCMV在T細(xì)胞內(nèi)增值復(fù)制。
　　 7.hMBL/rhMBL阻遏MD-DC的HCMV傳遞功能
　　 在共培養(yǎng)第4天，同組的5個(gè)孔MD-DC和T細(xì)胞被收集到1管，共7管，經(jīng)免疫磁株陽性分選法分選出

17、CD4?T細(xì)胞，CD3-APC單色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)分選前后T細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)從48％～55％上升到93％～99％；PP65-GAM-FITC流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T細(xì)胞內(nèi)各組HCMV PP65蛋白量從35.4％～％17.9不等，和熒光定量PCR法檢測(cè)T細(xì)胞內(nèi)各組HCMV DNA的量從28×103/ml～5.9×103/ml不等。表明MD-DC確實(shí)將其捕獲的HCMV傳遞給T細(xì)胞，并且HCMV在T細(xì)胞內(nèi)能增值。
　　 結(jié)論：
　　 1.成

18、功建立分泌rhMBL細(xì)胞株(CHO/rhMBL)，獲得高純度的rhMBL和hMBL；
　　 2.成功從人外周血單個(gè)核細(xì)胞衍生出高表達(dá)DC-SIGN的MD-DC;
　　 3.MD-DC具有捕獲HCMV并將其呈遞給T細(xì)胞的功能；
　　 4.rhMB和LhMBL均能阻遏MD-DC對(duì)HCMV的捕獲和呈遞功能，但rhMBL效果較hMBL略差：
　　 5.MD-DC捕獲HCMV并將其呈遞給T細(xì)胞的功能是通過DC-SI