Caveolin-1調(diào)控表皮生長因子受體活化在肺腺癌發(fā)病中的作用.pdf

1、目的:肺癌是目前世界上發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，已成為癌癥中的第一殺手，嚴重威脅人類生命健康。每年肺癌新發(fā)病例超過100多萬，其中非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)約占80％-85％,而肺腺癌是NSCLC的主要病理類型。肺腺癌最顯著的特征是高度浸潤和破壞性生長，它容易侵犯血管和淋巴管壁，進而出現(xiàn)血行和淋巴轉(zhuǎn)移。肺癌的發(fā)生發(fā)展是由多條信號轉(zhuǎn)導通路調(diào)節(jié)，多因素參與的復雜過程。如何對肺腺癌實

2、施有效的治療提高患者生存，已成為目前研究的重點和難點。我們對調(diào)控肺腺癌的信號轉(zhuǎn)導通路進行深入的探索，有助于闡明肺腺癌的發(fā)病機制，可為其治療找到新的靶點提供思路。
　　表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）由ErbB-1/EGFR、ErbB-2/HER-2、ErbB-3/HER-3和ErbB-4/HER-4四大成員組成。這些受體酪氨酸激酶家族成員是一類由膜外的配體結(jié)合區(qū)、跨膜區(qū)

3、和膜內(nèi)含有酪氨酸激酶活性的功能結(jié)構(gòu)域組成的跨膜糖蛋白。表皮生長因子受體通過與配體（如EGF）結(jié)合，從而導致胞內(nèi)酪氨酸激酶域活化，形成同源或異源二聚體，引起下游多條在細胞的分化、增殖、運動中起重要作用的信號通路（如Ras-Raf-MAPK、PI3K-Akt等）的激活。其中EGFR(ErbB-1)是此家族中最重要的成員。其過表達及活化與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。據(jù)研究，EGFR是一種與NSCLC進展和預后不良相關(guān)的標志性分子，NSCLC中約

4、40％-80％存在EGFR過表達，因此EGFR已成為一個重要的治療靶點，目前針對EGFR的靶向藥物已應(yīng)用于NSCLC的治療，但其單獨應(yīng)用的臨床有效率并不高且易產(chǎn)生耐藥，這就提示，EGFR信號轉(zhuǎn)導通路的活化可能還受其它多種分子的影響，進而在NSCLC的發(fā)生發(fā)展侵襲轉(zhuǎn)移的過程中起重要作用，還需要進一步分析研究。
　　小窩蛋白-1(Caveolin-1，Cav-1)是小窩蛋白家族中的一員，是細胞質(zhì)膜表面特異性膜內(nèi)陷囊泡(caveolae

5、)的重要標志性結(jié)構(gòu)蛋白，廣泛存在于各種細胞中，參與多種生命活動。Cav-1分子量21-24kDa，共由178個氨基酸殘基組成，其結(jié)構(gòu)特殊，無胞外區(qū)，位于中間的高度保守的疏水性區(qū)域（102-134氨基酸殘基）以發(fā)卡結(jié)構(gòu)鑲嵌在細胞膜內(nèi)，從而將該蛋白鏈分為N末端和C末端兩個區(qū)，其中主要的功能區(qū)域為N端的82-101殘基，Cav-1不僅主要通過此區(qū)域與膽固醇相互作用，而且還與各種信號分子（如EGFR）結(jié)合，從而調(diào)節(jié)下游信號通路。近年來Cav-1

6、逐漸受到人們的關(guān)注，其參與多種細胞的信號轉(zhuǎn)導及增殖、分化和凋亡，對腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有促進和抑制的雙重作用。
　　本研究主要探討Cav-1對肺腺癌細胞生物學行為的影響及其調(diào)控EGFR信號轉(zhuǎn)導通路的分子機制，為肺腺癌的治療提供新靶點。
　　首先，體外培養(yǎng)各人肺腺癌細胞株，觀察其Cav-1表達情況;選取Cav-1低表達的GLC-82細胞株，通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)，上調(diào)Cav-1的表達;利用MTT增殖實驗、Wound heaing（劃痕修

7、復實驗）和Transwell侵襲實驗觀察Cav-1對人肺腺癌GLC-82細胞增殖、遷移和侵襲等生物學行為的影響;經(jīng)western blot檢測EGFR及其下游通路中各分子的活化水平;體外裸鼠荷瘤實驗觀察Cav-1對GLC-82細胞成瘤能力的影響;收集臨床標本，通過免疫組織化學法探討人肺腺癌組織中Cav-1的表達與臨床病理及預后的關(guān)系。本研究分以下三個部分:
　　第一部分 Cav-1對肺腺癌GLC-82細胞生物學行為的影響及機制探討

8、
　　方法:
　　1、Western blot法檢測不同肺腺癌細胞中Cav-1的表達情況培養(yǎng)不同肺腺癌細胞株GLC-82、H1975、A549、H1650和H1299，western blot法檢測各細胞株Cav-1的表達水平。
　　2、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染建立過表達Cav-1的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株
　　將含人全長Cav-1基因的pcDNA3.1質(zhì)粒和空載體質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染低表達Cav-1的人肺腺癌GLC-82細胞，經(jīng)G418抗性篩選

9、，得到過表達Cav-1的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株(GLC-82/Cav-1)及其對照組細胞(GLC-82/pcDNA3.1);利用實時熒光定量PCR和Western blot法檢測穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株中Cav-1的mRNA和蛋白水平。
　　結(jié)果:
　　1、不同肺腺癌細胞株中Cav-1的表達情況
　　利用western blot檢測肺腺癌細胞GLC-82、H1975、A549、H1650和H1299中Cav-1的表達水平（0.12±0.00

10、，1.41±0.00，0.64±0.01，1.11±0.01，1.67±0.00），其中GLC-82細胞中Cav-1的表達水平是最低的（P＜0.01）。
　　2、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染肺腺癌細胞株中Cav-1水平的檢測
　　GLC-82/Cav-1細胞中Cav-1 mRNA的相對定量值（6.07±0.12）明顯高于GLC-82/pcDNA3.1細胞（0.09±0.01），同時Cav-1蛋白的表達量（0.74±0.05）明顯高于GLC-82

11、/pcDNA3.1細胞（0.09±0.01），二者均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。
　　3、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Cav-1肺腺癌細胞株的增殖情況
　　經(jīng)不同濃度(0nM、4nM、20nM、100nM)EGF刺激后，利用MTT法檢測各濃度OD值GLC-82/Cav-1組(0.68±0.04，0.79±0.05，0.85±0.03，0.96±0.05)均明顯高于GLC-82/pcDNA3.1組(0.56±0.02，0.64±0.03，0.7

12、3±0.02，0.82±0.02)，均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　第二部分 Cav-1對肺腺癌細胞在裸鼠體內(nèi)成瘤性的影響及其機制研究
　　方法:
　　將GLC-82/Cav-1和GLC-82/pcDNA3.1細胞分別接種于5周齡雌性BALB/C裸鼠右前肢背部。每組6只裸鼠。調(diào)整細胞濃度為1×107/ml，即每只1×106個細胞。每3天觀察1次，并繪制腫瘤生長曲線、觀察體重變化。8周后處死裸鼠，剝?nèi)×鼋M織后稱重并

13、拍照。一方面，提取瘤組織總蛋白，利用western blot檢測不同瘤組織中Cav-1和EGFR及其下游信號分子的變化。另一方面，石蠟包埋瘤組織，免疫組織化學法檢測Cav-1、 Ki-67和p-EGFR的表達情況。
　　結(jié)果:
　　1、裸鼠模型
　　GLC-82/Cav-1組裸鼠荷瘤體積明顯大于GLC-82/pcDNA3.1組，且隨時間的延長差異越大，有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。處死裸鼠后，稱取瘤重，GLC-82/C

14、av-1組瘤重明顯高于GLC-82/pcDNA3.1組，有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。GLC-82/Cav-1組裸鼠體重稍高于GLC-82/pcDNA3.1組，但無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　2、免疫組化檢測瘤組織中蛋白表達水平
　　利用免疫組化法檢測瘤組織中蛋白的表達水平，GLC-82/Cav-1組Cav-1、p-EGFR、Ki-67的蛋白表達水平明顯高于對照組，有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　第三部分 C

15、av-1在肺腺癌組織中的表達及其與臨床病理特征相關(guān)性
　　方法:
　　隨機選取的68例手術(shù)切除的肺腺癌組織石蠟標本，病例資料完整，采用免疫組織化學第二代聚合酶二步法(PV)檢測其Cav-1、EGFR和Ki-67的表達情況。分析研究Cav-1在肺腺癌組織中的表達及其與臨床病理特征的相關(guān)性。
　　結(jié)果:
　　1、Cav-1、EGFR和Ki-67在肺腺癌組織中的表達特點
　　Cav-1和EGFR蛋白在肺腺癌組織中

16、主要分布在細胞膜和細胞質(zhì)，陽性呈棕黃色或棕褐色顆粒狀，胞核不著色。Cav-1蛋白陽性表達率為51.5％(35/68)，EGFR蛋白表達陽性率為52.9％(36/68)。Ki-67蛋白在細胞核表達，陽性呈棕黃色或棕褐色顆粒狀，陽性表達率為50％(34/68)。
　　2、Cav-1和Ki-67與肺腺癌臨床病理特征的關(guān)系
　　在68例肺腺癌患者組織中，Cav-1蛋白的高表達與腫瘤分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期有關(guān)，其差異均有統(tǒng)

17、計學意義(P＜0.05)，但是與年齡、性別和腫瘤大小等無關(guān)。Ki-67蛋白的表達與有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期有關(guān)，其差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，但是與年齡、性別、腫瘤大小及分化程度等無關(guān)。
　　結(jié)論:
　　1、體外實驗表明上調(diào)Cav-1表達可促進肺腺癌細胞株的增殖、遷移和侵襲能力;
　　2、裸鼠成瘤實驗表明上調(diào)Cav-1表達可促進肺腺癌細胞在裸鼠體內(nèi)的成瘤能力;
　　3、Cav-1通過調(diào)控肺腺癌細胞EGFR