表皮生長因子受體EGFR與自噬在肺腺癌中關(guān)系的研究.pdf

1、目的：本論文分為兩大部分，第一部分從基礎(chǔ)細(xì)胞實驗層面研究肺腺癌A549細(xì)胞中EGFR表達量與自噬活性的關(guān)系；第二部分從臨床實驗角度研究，肺腺癌患者胸水中癌細(xì)胞EGFR突變狀態(tài)與自噬活性是否相關(guān)。下面分別闡述：
　　(一)研究顯示肺癌為全世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率極高的癌癥，通過特異性RNA干擾介導(dǎo)技術(shù)降低表皮生長因子受體EGFR的表達，來探究EGFR對肺腺癌A549細(xì)胞的自噬活性的影響，為肺癌實驗及臨床研究提供新的思路。
　　

2、(二)隨著對肺癌發(fā)生、發(fā)展中分子生物學(xué)機制、診斷和預(yù)后以及肺癌中癌基因突變的深入研究，目前輔助EGFR靶向治療的新型診斷方法已成為現(xiàn)階段研究的熱點，在此我們運用Real Time RT-PCR方法檢測肺腺癌患者胸水細(xì)胞，比較EGFR突變組與非突變組的自噬相關(guān)基因LC3和Beclin1的表達是否有差異，探索自噬活性與EGFR突變狀態(tài)是否相關(guān)，為臨床及實驗研究提供新的思路和突破點。
　　方法：
　　(一)
　　1應(yīng)用基因轉(zhuǎn)

3、染技術(shù)，將EGFR特異性干擾RNA轉(zhuǎn)染入肺腺癌A549細(xì)胞中，應(yīng)用Real Time RT-PCR(real time reverse transcription polymerase chain reaction)、Western-Blot方法檢測外源性EGFR特異性干擾RNA(EGFR siRNA)介導(dǎo)的表皮生長因子EGFR轉(zhuǎn)錄后的基因沉默效應(yīng)。
　　2選取處于對數(shù)生長期的肺腺癌A549細(xì)胞，將其接種于六孔板內(nèi)，本實驗可分為四

4、組：轉(zhuǎn)染EGFR siRNA組、轉(zhuǎn)染negative control siRNA組、轉(zhuǎn)染試劑組和正常組。經(jīng)siRNA轉(zhuǎn)染后，分組細(xì)胞皆經(jīng)適量濃度EGF處理半個小時后，應(yīng)用Westrn-Blot方法檢測EGFR siRNA轉(zhuǎn)錄A549細(xì)胞前后自噬效應(yīng)分子LC3蛋白表達水平的變化，并分析其與表皮生長因子受體EGFR之間相互作用的關(guān)系。
　　3用透射電子顯微鏡(Transmission electron microscopy, TEM)

5、對比觀察轉(zhuǎn)染EGFR特異性干擾RNA(EGFR siRNA)組和陰性對照組siRNA(control siRNA)組自噬小體的變化，判斷細(xì)胞內(nèi)自噬情況。
　　(二)收集河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院癌檢中心2015年9月至2015年12月初診疑似肺癌患者胸水。
　　1蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining，HE染色法)對患者胸水細(xì)胞涂片進行診斷篩查。
　　2免疫細(xì)胞化學(xué)法(Immunochemi

6、stry,ICC)進一步診斷細(xì)胞涂片上癌細(xì)胞的類型。
　　3 ARMS(amplification refractory mutation system)實時定量熒光PCR法擴增癌細(xì)胞檢測EGFR基因是否突變，進而把患者分為EGFR突變組與EGFR非突變組。
　　4 Real Time RT-PCR方法檢測胸水中癌細(xì)胞中自噬效應(yīng)分子LC3和Beclin1的mRNA水平，運用統(tǒng)計學(xué)方法比較EGFR基因突變組與EGFR非突變組自

7、噬效應(yīng)分子LC3與Beclin1是否有差異性。
　　結(jié)果：
　　(一)
　　1 Western-Blot實驗結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染EGFR特異性干擾RNA的A549細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染 EGFR特異性 siRNA(1,3)后，表皮生長因子EGFR的蛋白水平上表達量均有明顯降低，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，其表達下降量最為明顯的是EGFR siRNA-1。Real Time RT-PCR實驗結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染EGFR siRNA-1后，

8、EGFR的mRNA表達量顯著下降具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。
　　2 EGFR特異性 siRNA（EGFR siRNA）沉默表皮生長因子EGFR后， Western-Blot結(jié)果表明在蛋白表達水平自噬特異性效應(yīng)物 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值顯著增加。
　　3透射電子顯微鏡對比觀察轉(zhuǎn)染EGFR特異性siRNA（EGFR siRNA）組和陰性對照 siRNA（control siRNA）組，結(jié)果顯示EGFRsiRNA組細(xì)胞中

9、形成較多大量雙層膜包裹未被完全降解的細(xì)胞內(nèi)容物的自噬小體。
　　(二)
　　1 HE常規(guī)染色涂片分別經(jīng)兩位細(xì)胞病理學(xué)醫(yī)生初診，均可見豐富的惡性腫瘤細(xì)胞，細(xì)胞呈多形型，細(xì)胞核增大，染色質(zhì)粗糙，核漿比增大，即可滿足進一步免疫細(xì)胞化學(xué)染色與ARMS法檢測的需要。
　　2免疫細(xì)胞化學(xué)染色法中，肺腺癌特異性標(biāo)記抗體TTF-1及NapsinA等在細(xì)胞學(xué)涂片中都表現(xiàn)為陽性，即通過免疫細(xì)胞化學(xué)染色進一步診斷患者胸水屬于肺腺癌。

10、　　3 ARMS法檢測惡性胸水共計40例，其中檢測出EGFR非突變組15例,突變組25例。
　　4 Real Time RT-PCR檢測突變組與非突變組中的自噬相關(guān)蛋白LC3在統(tǒng)計學(xué)上有顯著差異性，而Beclin1在統(tǒng)計學(xué)上無顯著差異性。
　　結(jié)論：
　　1特異性EGFR siRNA可有效發(fā)揮EGFR轉(zhuǎn)錄后基因沉默效應(yīng)(PTGs， post-transcriptional gene silencing)。
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