表皮生長因子受體調(diào)控內(nèi)毒素血癥心肌TNF-alpha生成的機制研究.pdf

1、目的：
　　通過培養(yǎng)原代心肌細胞以及在野生型C57BL/6小鼠和β-arrestin2基因敲除C57BL/6小鼠上，從細胞水平和在體水平，探討轉(zhuǎn)激活EGFR是否能夠?qū)?nèi)毒素血癥中心肌組織或心肌細胞產(chǎn)生TNF-α有影響，另外β-arrestin2是否也會對LPS轉(zhuǎn)激活EGFR起到作用。
　　材料和方法：
　　1.動物準備與模型制備
　　SPF級C57BL/6雄性小鼠，6-8周齡，體重22-25g，購于南方醫(yī)科大學實

2、驗動物中心。β-arrestin2基因敲除小鼠購于Jackson實驗室后在南方醫(yī)院動物中心進行繁殖。小鼠飼養(yǎng)在南方醫(yī)院實驗動物中心:條件:室溫25-27℃，濕度50％-70％，5只/籠，自由攝取食物和水，早晚定時進行燈光變換，避免強光、噪音刺激。本實驗通過腹腔注射LPS(5mg/kg)制成內(nèi)毒素模型小鼠。
　　2.原代心肌細胞培養(yǎng)
　　使用D-Hanks稀釋的高純度膠原酶Liberase TH（Roche,Cat.＃1198

3、8468）稀釋到22.5μg/ml用于消化心臟組織。將新生小鼠心臟置于10ml無菌離心管中剪碎，用D-Hanks液平衡、清洗兩次后，于22.5μg/ml的Liberase TH中37℃預消化10 min，棄上清。再加入3ml左右的Liberase TH于37℃消化15min，每隔2min左右輕柔震蕩一次。收集上清，800×g，5min離心得到心肌細胞，使用M199+10％胎牛血清+1％青鏈霉素重懸細胞。另外將剩下的心臟組織再次加入3ml

4、左右的Liberase TH于37℃消化15min，用同樣的方法離心、重懸心肌細胞（必要時，還可以將剩下的心臟組織進行第三次消化）。將兩次得到的心肌細胞混合在一起并預種植于10cm細胞培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)45-60min。隨后使用移液器輕柔吹洗細胞，并過濾于50ml離心管中，取10μl計數(shù)，按照每孔50×104的密度，接種于24孔板中（24孔板預先使用1％的明膠封板1h，隨后吸棄明膠，并于室溫中干燥后使用），在M199+10％胎牛血清+1％青

5、鏈霉素中培養(yǎng)24h后實驗。
　　3.實驗過程
　　3.1 PD168393和厄洛替尼對LPS轉(zhuǎn)激活EGFR的影響
　　首先，在體外培養(yǎng)原代心肌細胞，原代心肌細胞分為6組:對照組:原代心肌細胞中加入鹽水;
　　PD168393組:原代心肌細胞中加入PD168393使其終濃度為50μM;
　　厄洛替尼組:原代心肌細胞中加入厄洛替尼使其終濃度為20μM;
　　LPS組:原代心肌細胞中加入濃度為4μg/ml的

6、LPS;
　　LPS+PD168393組:原代心肌細胞中先加入終濃度為50μM的PD168393，0.5小時后加入濃度為4μg/ml的LPS;
　　LPS+厄洛替尼組:原代心肌細胞中先加入終濃度為20μM的厄洛替尼，0.5小時后加入濃度為4μg/ml的LPS。
　　經(jīng)過上述處理后，于0.5小時后收集細胞，用western blot的方法檢測磷酸化的EGFR和EGFR情況。
　　其次，進行在體實驗研究。16只野生型

7、C57BL/6小鼠隨機分為對照組、厄洛替尼組、LPS組和LPS+厄洛替尼組，每組4只。
　　各組小鼠于LPS處理1小時后取心臟組織進行western blot檢測磷酸化EGFR和EGFR的情況。
　　3.2 研究抑制EGFR磷酸化對LPS介導的TNF-α生成是否有影響
　　首先，在體外培養(yǎng)原代心肌細胞，原代心肌細胞分為9組:
　　對照組:原代心肌細胞中加入鹽水;
　　厄洛替尼20μM組:原代心肌細胞中加入厄

8、洛替尼使其終濃度為20μM;
　　PD16839350μM組:原代心肌細胞中加入PD168393使其終濃度為50μM;
　　LPS組:原代心肌細胞中加入濃度為4μg/ml的LPS;
　　LPS+PD1683932μM組:原代心肌細胞中加入PD168393使其終濃度為2μM預處理30min后加入濃度為4μg/ml的LPS;
　　LPS+PD16839310μM組:原代心肌細胞中加入PD168393使其終濃度為10μ

9、M預處理30min后加入濃度為4μg/ml的LPS;
　　LPS+PD16839350μM組:原代心肌細胞中加入PD168393使其終濃度為50μM預處理30min后加入濃度為4μg/ml的LPS;
　　LPS+厄洛替尼10μM組:原代心肌細胞中加入厄洛替尼使其終濃度為10μM預處理30min后加入濃度為4μg/ml的LPS;
　　LPS+厄洛替尼20μM組:原代心肌細胞中加入厄洛替尼使其終濃度為20μμM預處理30m

10、in后加入濃度為4μg/ml的LPS;
　　各組分別于LPS處理后4小時用RT-PCR的方法檢測TNF-α的mRNA水平，用ELISA的方法檢測培養(yǎng)液中TNF-α的蛋白水平。
　　其次，我們進行了在體實驗，16只野生型C57BL/6小鼠隨機分為對照組、厄洛替尼組、LPS組和LPS+厄洛替尼組，每組4只。
　　各組小鼠于LPS處理6小時后取心臟組織進行ELISA法檢測TNF-α的蛋白水平。
　　3.3 LPS轉(zhuǎn)激活

11、EGFR后調(diào)控磷酸化的ERK1/2和p38的研究按照上述方法分離、培養(yǎng)原代心肌細胞。原代心肌細胞分為6組:對照組:原代心肌細胞加入鹽水;
　　厄洛替尼組:原代心肌細胞中加入終濃度為20μM的厄洛替尼;
　　PD168393組:原代心肌細胞中加入終濃度為50μM的PD168393;
　　LPS組:原代心肌細胞濃度為4μg/ml的LPS;
　　LPS+厄洛替尼組:原代心肌細胞中加入厄洛替尼使其終濃度為20μM預處理3

12、0min后加入濃度為4μg/ml的LPS;
　　LPS+PD168393組:原代心肌細胞中加入PD168393使其終濃度為50μM預處理30min后加入濃度為4μg/ml的LPS;
　　LPS處理后1.5小時收集細胞，用western blot的方法檢測磷酸化p38，磷酸化ERK1/2的情況。
　　其次，我們進行了體內(nèi)實驗。16只野生型C57BL/6小鼠隨機分為對照組、厄洛替尼組、LPS組和LPS+厄洛替尼組，每組4只

13、。
　　各組小鼠于LPS處理2小時后取心臟組織進行western blot法檢測磷酸化ERK1/2,磷酸化p38水平。
　　結果：
　　1.PD168393和厄洛替尼可以有效抑制LPS介導的EGFR磷酸化
　　我們發(fā)現(xiàn)在體外實驗中，原代心肌細胞中給予LPS(4μg/ml)處理0.5小時后可以轉(zhuǎn)激活EGFR，而給予PD168393（50μM）或厄洛替尼(20μM)預處理后可以抑制EGFR的激活((p＜0.05))。

14、進一步我們在體內(nèi)實驗中，同樣觀察到LPS刺激后可以轉(zhuǎn)激活EGFR，而在厄洛替尼預處理組可以抑制EGFR的轉(zhuǎn)激活((p＜0.05))。說明在體內(nèi)和體外，LPS可介導心肌細胞EGFR激活，且LPS介導的EGFR激活可以部分被EGFR可逆性抑制劑厄洛替尼和非可逆性抑制劑PD168393所拮抗。
　　2.抑制EGFR磷酸化可以降低LPS介導的TNF-a的合成
　　我們在體外培養(yǎng)原代心肌細胞，并分別給予不同濃度的特異性EGFR磷酸化抑

15、制劑PD168393(非可逆性)或者厄洛替尼（可逆性）預處理30min，我們發(fā)現(xiàn)LPS刺激后，TNF-α的mRNA和蛋白合成顯著增加，而預先給予PD168393或厄洛替尼處理30min的原代心肌細胞與LPS組相比，可以顯著降低TNF-α的mRNA和蛋白水平(p＜0.05)。而隨著抑制劑濃度的提高，對于TNF-α的mRNA和蛋白合成的抑制作用也相應增加。而在體內(nèi)實驗中，我們同樣發(fā)現(xiàn)與LPS組相比，預先給予抑制劑處理的小鼠心肌細胞中的TNF

16、-α的mRNA和蛋白合成是顯著下降的(p＜0.05)。
　　3.LPS轉(zhuǎn)激活EGFR調(diào)控ERK1/2和p38的磷酸化
　　我們在體外實驗中檢測原代心肌細胞在LPS、PD168393、厄洛替尼不同處理后的ERK1/2和p38磷酸化水平，我們發(fā)現(xiàn)在體外實驗中，LPS刺激原代心肌細胞1小時后可以觀察到ERK1/2和p38的磷酸化，而預先給予PD168393或厄洛替尼處理的心肌細胞再接受LPS刺激時，LPS刺激引起的ERK1/2和p

17、38磷酸化水平下降了。相應的在體內(nèi)實驗中，LPS刺激后，小鼠心臟組織出現(xiàn) ERK1/2和p38磷酸化，而預先給予抑制劑厄洛替尼后，我們發(fā)現(xiàn)LPS刺激引起的ERK1/2和p38磷酸化被抑制了。這充分說明ERK1/2和p38參與了LPS介導的心肌細胞TNF-α的產(chǎn)生。
　　結論：
　　我們的研究證明，在內(nèi)毒素血癥中，LPS轉(zhuǎn)激活EGFR對調(diào)節(jié)心臟來源的TNF-α的mRNA和蛋白水平起到重要作用。通過使用EGFR抑制劑PD1683

18、93或者厄洛替尼抑制EGFR的磷酸化，可以降低LPS刺激引起的p38和ERK1/2的磷酸化。LPS刺激后β-arrestin2基因敲除組小鼠，與對照組相比磷酸化EGFR及其下游信號通路中的p38和ERK1/2的磷酸化是下降的，說明LPS轉(zhuǎn)激活EGFR需要β-arrestin2參與。厄洛替尼抑制內(nèi)毒素血癥小鼠心肌的EGFR激活能夠有效改善左心室射血功能和改善心功能障礙，提高小鼠生存率。這些結果提供了EGFR在內(nèi)毒素血癥心肌TNF-α生成之