外周血CD34+細(xì)胞移植治療肢體重度缺血的基礎(chǔ)與臨床研究.pdf

1、第一部分人外周血CD34+細(xì)胞的體外原代培養(yǎng)鑒定及生物學(xué)特性
　　目的:通過(guò)梯度密度離心法和免疫磁珠分離法從人體外周血中獲取CD34+細(xì)胞，在體外原代培養(yǎng)、擴(kuò)增、鑒定、凍存與復(fù)蘇，探討其生物學(xué)特性，為患者再次干細(xì)胞移植提供可能的干細(xì)胞來(lái)源。
　　方法:使用梯度密度離心法采集人外周血中單個(gè)核細(xì)胞，應(yīng)用免疫磁珠吸附法獲取CD34+細(xì)胞，在含有生長(zhǎng)因子的X-VIVO培養(yǎng)液和高糖DMEM培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)擴(kuò)增。光鏡觀察細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)特

2、性;全自動(dòng)活細(xì)胞觀測(cè)分析系統(tǒng)(Cell-IQ)動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞分裂及遷移;免疫熒光技術(shù)對(duì)其表面標(biāo)志物CD34及CD133進(jìn)行鑒定;凍存CD34+細(xì)胞1年后復(fù)蘇觀察細(xì)胞活性。
　　結(jié)果:原代培養(yǎng)的CD34+細(xì)胞在X-VIVO培養(yǎng)液中呈懸浮生長(zhǎng)，3d細(xì)胞集落形成，5d有少量細(xì)胞開(kāi)始貼壁生長(zhǎng)，7d紡錘形的細(xì)胞數(shù)量增多，9d開(kāi)始出現(xiàn)細(xì)胞碎片，此時(shí)懸浮細(xì)胞與貼壁細(xì)胞分開(kāi)培養(yǎng)，貼壁細(xì)胞用高糖DMEM培養(yǎng)，懸浮細(xì)胞繼續(xù)用X-VIVO培養(yǎng)，14d懸浮

3、細(xì)胞大部分死亡，貼壁細(xì)胞集落形成。Cell-IQ動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞平均的分裂時(shí)間為90分鐘，幾乎所有的懸浮細(xì)胞均向中央移動(dòng)。免疫熒光鑒定細(xì)胞表面標(biāo)志物CD34(+)和CD133(+)。-80℃冰箱直接凍存，1年后復(fù)蘇，應(yīng)用Cryostor凍存液，細(xì)胞活力為(89.0±2.58)％，應(yīng)用DMSO凍存液細(xì)胞活力為（84.9±3.28）％，兩者有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:純化的CD34+細(xì)胞在體外培養(yǎng)擴(kuò)增是可行的，凍存復(fù)蘇后對(duì)細(xì)胞的活力影響較小

4、，為患者再次移植提供足夠的干細(xì)胞來(lái)源成為可能。
　　第二部分CD34+細(xì)胞移植治療裸鼠后肢缺血的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:觀察人外周血CD34+細(xì)胞移植治療裸鼠后肢動(dòng)脈缺血的效果，并且探討其可能的機(jī)制。
　　方法:裸鼠36只，隨機(jī)分為CD34組、X-VIVO組和假手術(shù)組，每組12只，CD34組、X-VIVO組剝離左側(cè)股動(dòng)脈至胭動(dòng)脈水平，制備成裸鼠后肢動(dòng)脈缺血模型，觀察其后肢缺血情況，假手術(shù)組不剝離血管，其余同前兩組。飼養(yǎng)1周

5、后CD34組裸鼠給予含有CD34+細(xì)胞(1×105cells)的X-VIVO培養(yǎng)液0.1ml注射于患肢缺血肌肉組織中，X-VIVO組裸鼠注射不含CD34+細(xì)胞的X-VIVO培養(yǎng)液0.1ml，假手術(shù)組僅注射生理鹽水0.1ml，飼養(yǎng)2周后取裸鼠內(nèi)收肌和半膜肌標(biāo)本，抗CD31和抗CD34免疫組織化學(xué)染色，顯示血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管密度;RealTime-PCR檢測(cè)組織中VEGF和bFGF mRNA的表達(dá)情況;
　　結(jié)果:免疫組化染色顯示CD

6、34組微血管密度較X-VIVO組和假手術(shù)組明顯增加。RT-PCR檢查顯示CD34組VEGF和bFGF mRNA表達(dá)最強(qiáng)，其次是X-VIVO組(P＜0.05)，假手術(shù)組則最低(P＜0.05)。
　　結(jié)論:應(yīng)用CD34+細(xì)胞移植可以明顯促進(jìn)血管新生、側(cè)枝血管形成進(jìn)而增加下肢缺血組織的血流灌注。
　　第三部分純化自體外周血CD34+細(xì)胞移植治療肢體重度缺血的臨床研究
　　目的:研究臨床應(yīng)用粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)動(dòng)員

7、后經(jīng)外周血采集單個(gè)核細(xì)胞(PB-MNC)，免疫磁珠分選儀提取純化CD34+細(xì)胞移植治療肢體重度缺血的安全性，可行性和有效性。
　　方法:自2009年5月至2011年7月，入組患者共25例，其中治療下肢25條和上肢3條，平均年齡44±12歲，均不具備外科血管重建條件。G-CSF(5-10μg/kg)動(dòng)員第5天采集外周血單個(gè)核細(xì)胞，分選獲得純化CD34+細(xì)胞，肢體肌肉局部注射，所有病例分為3組:低劑量組(105/kg)、中劑量組(5×

8、105/kg)和高劑量組(106/kg)。觀察不良反應(yīng)和缺血緩解情況。
　　結(jié)果:隨訪6-33個(gè)月，1個(gè)月和2個(gè)月時(shí)Wong-Baker FACES疼痛評(píng)分由術(shù)前7±2分別下降到3±3(P=0.0000)和1±2(P=0.0000);3個(gè)月和6個(gè)月時(shí)，平板試驗(yàn)無(wú)疼痛步行時(shí)間從術(shù)前4±3min上升到13±7min(P=0.0005)和18±6min(P=0.0000);踝肱指數(shù)從術(shù)前0.46±0.21上升到0.60±0.17(P=0

9、.003)和0.67±0.15(P=0.001);經(jīng)皮氧分壓由27±10mmHg升至41±11mmHg(P=0.0001)和55±12mmHg(P=0.0000);14例潰瘍患者愈合10例，4例在3個(gè)月內(nèi)行截肢術(shù);Kaplan Meier生存分析法計(jì)算6個(gè)月保肢率為84％(95％可信區(qū)間為0.63～0.94)。比較3組（低劑量組5例;中劑量組11例;高劑量組9例），1個(gè)月時(shí)Wong-Baker FACES疼痛評(píng)分高劑量組(6.3±1.7