CyclinB1-Cdc2和Polo-like kinase1在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病中的作用研究.pdf

1、研究背景:子宮內(nèi)膜異位癥是一種主要發(fā)生在育齡期婦女的常見婦科疾病.它表現(xiàn)出來的盆腔疼痛和不孕等臨床癥狀已經(jīng)嚴(yán)重影響了現(xiàn)代女性的身心健康.近年來日益受到研究者的廣泛關(guān)注.子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病率在普通人群中為10﹪-15﹪.目前確切的病因和病理機制仍不清楚.研究發(fā)現(xiàn),子宮內(nèi)膜異位癥與卵巢癌的發(fā)生高度相關(guān),甚至被很多學(xué)者認(rèn)為是卵巢癌的癌前病變.眾所周知,腫瘤的主要特征是增生和惡性轉(zhuǎn)化.而細(xì)胞增生和惡性轉(zhuǎn)化都是控制細(xì)胞分裂(即細(xì)胞周期)異常引起

2、的后果.研究證實,cvclinB1/cdc2及PLK1是控制細(xì)胞周期的2個關(guān)鍵性調(diào)節(jié)因子,在腫瘤的增生和惡性轉(zhuǎn)化過程中起了重要作用.已經(jīng)在多種腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)有CyclinB1/cdc2及PLK1的表達(dá)異常.正因為子宮內(nèi)膜異位癥與腫瘤有著諸多的相似之處,因此我們不難想到,這些細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白是否也在子宮內(nèi)膜異位癥的患者中表達(dá)異常而且在其發(fā)病中起了某種重要作用呢?目前對一些在細(xì)胞周期調(diào)節(jié)中控制G1/S期轉(zhuǎn)化的細(xì)胞周期蛋白與子宮內(nèi)膜異位癥的關(guān)

3、系已經(jīng)有了一些研究,如cyclinA、cvclinD和CvclinE等,但是對細(xì)胞周期調(diào)節(jié)中控制G2/M期轉(zhuǎn)化的細(xì)胞周期蛋白與子宮內(nèi)膜異位癥的相關(guān)性研究目前尚未見報道. 本研究是國際上首次對CvclinB1/Cdc2和PLK1與子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生的相關(guān)性進(jìn)行研究和報道,目的是探討子宮內(nèi)膜異位癥的病理發(fā)生機制,為尋求子宮內(nèi)膜內(nèi)異癥新的預(yù)防和治療方法提供思路. 第一部分 子宮內(nèi)膜異位癥患者子宮內(nèi)膜細(xì)胞與正常人子宮內(nèi)膜細(xì)胞體外

4、生長特性的比較 目的:通過比較子宮內(nèi)膜異位癥患者異位及在位內(nèi)膜細(xì)胞與正常人子宮內(nèi)膜細(xì)胞體外生長特性的比較來探討子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機理. 材料與方法:取因子宮內(nèi)膜異位癥行開腹或腹腔鏡手術(shù)的內(nèi)異癥患者異位內(nèi)膜21例,同時取行開腹手術(shù)的內(nèi)異癥患者在位內(nèi)膜6例,對照組因子宮漿膜下肌瘤行開腹手術(shù)切除子宮的正常女性在位子宮內(nèi)膜6例.患者年齡21-47歲,術(shù)前6個月未用過激素治療,無全身性合并癥.采用體外細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)合細(xì)胞生長計數(shù)和細(xì)

5、胞分裂指數(shù)計數(shù)的方法對三組子宮內(nèi)膜細(xì)胞的體外生長特性進(jìn)行比較. 結(jié)論:子宮內(nèi)膜異位癥患者在位及異位內(nèi)膜有著與正常人子宮內(nèi)膜不同的增殖能力,這種增高的細(xì)胞增殖能力可能是子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生的病理基礎(chǔ),可能與異位內(nèi)膜在腹腔中的粘附、存活及生長有關(guān). 第二部分 CyclinBl、Cdc2及Polo-like kinasel在子宮內(nèi)膜異位癥患者子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá) 目的:通過細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白CyclinBl及其調(diào)節(jié)蛋白C

6、dc2以及Polo-likekinasel(PLK1)在子宮內(nèi)膜異位癥中的表達(dá),探討CyclinB1/Cdc2和PLK1在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生中的作用. 材料與方法:子宮內(nèi)膜異位癥患者(以下簡稱內(nèi)異癥)異位內(nèi)膜29份(增生期17份、分泌期12份),同時獲取內(nèi)異癥在位內(nèi)膜20份(增生期11份、分泌期9份).正常人子宮內(nèi)膜30例(增生期16份、分泌期14份).采用RT-PCR、蛋白免疫印跡(Western blotting)以及免疫組

7、織化學(xué)的方法檢測上述三組子宮內(nèi)膜組織中CyclinB1、Cdc2以及PLK1的表達(dá).同時檢測了Ki-67在三組子宮內(nèi)膜組織中免疫組化的表達(dá).采用直線相關(guān)分析法對Ki-67免疫組化的表達(dá)結(jié)果與CyclinB1和PLK1的蛋白表達(dá)水平進(jìn)行相關(guān)分析. 結(jié)論:CyclinBl和PLKl在子宮內(nèi)膜異位癥患者的異位和在位子宮內(nèi)膜組織上mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平均高于正常人子宮內(nèi)膜組織.Ki-67在三組子宮內(nèi)膜組織中免疫組化的陽性表達(dá)率與Cy

8、clinBl及TLPLKl的蛋白表達(dá)有較好的相關(guān)性.因此CyclinBl和PLKl可能參與了子宮內(nèi)膜異位癥的病理發(fā)生,而且可能和Ki-67一樣,都可以用來預(yù)測子宮內(nèi)膜細(xì)胞的增殖能力. 第三部分 CyclinBl/Cdc2抑制劑Alsterpaullone對子宮內(nèi)膜異位癥患者子宮內(nèi)膜細(xì)胞體外生長的影響 目的:進(jìn)一步證明CyclinBl/Cdc2在子宮內(nèi)膜異位癥患者子宮內(nèi)膜細(xì)胞增殖中的作用,以期尋找治療子宮內(nèi)膜異位癥的新途徑

9、和新方法. 材料與方法:材料獲取的方法及數(shù)量同第一部分,三組子宮內(nèi)膜細(xì)胞分別設(shè)置處理組和對照組.采用細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)合細(xì)胞分裂指數(shù)計數(shù)、噻唑藍(lán)比色法(MTT)、蛋白免疫印跡及流式細(xì)胞儀細(xì)胞周期分析等方法檢測了給Alsterpaullone(Alp)前后三組子宮內(nèi)膜細(xì)胞的體外生長情況及CyclinB1和PLK1的蛋白表達(dá)量的變化. 結(jié)論:CyclinB1/Cdc2在調(diào)控子宮內(nèi)膜異位癥患者在位和異位內(nèi)膜細(xì)胞的增殖生長中起了重要作用

10、.臨床中將來有可能利用抑制劑Alp來達(dá)到治療或輔助治療子宮內(nèi)膜異位癥的作用. 第四部分 PLK1 siRNA小分子對子宮內(nèi)膜異位癥患者子宮內(nèi)膜細(xì)胞體外生長的影響 目的:進(jìn)一步證明PLK1在子宮內(nèi)膜異位癥患者在位和異位內(nèi)膜細(xì)胞增殖中的作用,以期尋找治療子宮內(nèi)膜異位癥的新途徑和新方法. 材料與方法:材料的獲取方法及數(shù)量同第一部分.針對人類PLK1基因為靶位點設(shè)計合成siRNA片段,以慢病毒為載體,對子宮內(nèi)膜異位癥在位

11、、異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞及正常人子宮內(nèi)膜細(xì)胞感染48h(三組細(xì)胞分別設(shè)置處理組和對照組),觀察三組細(xì)胞病毒感染前后細(xì)胞的體外生長變化及cvclinB1和PLK1蛋白表達(dá)量的變化.采用的方法有流式細(xì)胞儀細(xì)胞生長周期分析及蛋白免疫印跡技術(shù). 結(jié)論:PLK1 siRNA對子宮內(nèi)膜異位癥患者的子宮內(nèi)膜PLK1基因表達(dá)具有明顯的消除作用,在細(xì)胞水平上顯著抑制了異位癥內(nèi)膜細(xì)胞的分裂和生長.siRNA敲除PLK1將來有可能成為治療子宮內(nèi)膜異位癥新的