糖尿病外周血白細(xì)胞呼吸爆發(fā)與G6PD的相關(guān)性研究.pdf

1、隨著生活水平的提高、生活方式的改變和人口的老齡化，糖尿病患病率在世界范圍內(nèi)呈現(xiàn)出上升趨勢，成為繼心腦血管疾病、腫瘤之后的又一嚴(yán)重危害大眾健康的慢性非傳染性疾病。目前全球已診斷的糖尿病患者超過1.5億人，預(yù)測到2025年將增至3億人。 糖尿病合并嚴(yán)重感染是糖尿病最常見的并發(fā)癥之一。在應(yīng)用胰島素治療以前，感染是糖尿病的主要死因，直至二十世紀(jì)五十年代，糖尿病患者仍有較高的死亡率。近年來，隨著胰島素和抗生素的應(yīng)用，糖尿病并發(fā)感染的死亡率

2、有所下降，但仍占糖尿病死亡原因第二位。糖尿病患者的感染發(fā)生率高達36.8％，并仍有上升的趨勢。因此，有效地防治感染對于降低糖尿病患者的死亡率非常重要。 目前認(rèn)為糖尿病患者易并發(fā)各種感染，主要與高血糖狀態(tài)、機體防御機能減弱、糖尿病的并發(fā)癥、營養(yǎng)不良等因素有關(guān)，其中比較受關(guān)注的是機體防御機能減弱。控制不良或伴酮癥酸中毒的糖尿病患者常同時有多種防御機能缺陷，對入侵微生物的的各反應(yīng)階段都被抑制，從而極易感染，且程度嚴(yán)重。白細(xì)胞在抗感染方

3、面發(fā)揮著重要作用。它參與機體非特異性免疫和特異性免疫過程，有吞噬、殺死病原體的作用，是機體抗感染的第一道防線。許多研究對糖尿病患者白細(xì)胞吞噬殺菌功能進行了研究，發(fā)現(xiàn)血糖控制差的糖尿病患者，中性粒細(xì)胞的趨化、粘附、吞噬及氧化殺菌等功能均較正常人低，且與病情控制及代謝紊亂的程度有關(guān)。多數(shù)糖尿病患者白細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)亦有異常。近年來，對糖尿病患者白細(xì)胞吞噬殺菌功能降低機制的研究越來越重視，國內(nèi)外很多學(xué)者分別從糖尿病患者白細(xì)胞膜脂流動性、胞內(nèi)堿性

4、磷酸酶活力、溶酶體酶、調(diào)理素、Ca<'2+>濃度、山梨醇及肌醇代謝狀態(tài)等方面進行了研究，但仍無定論。呼吸爆發(fā)是白細(xì)胞激活后行使殺菌功能的主要途徑。NADPH是呼吸爆發(fā)的必需物質(zhì)，它的生成有賴于細(xì)胞內(nèi)磷酸戊糖途徑(PPP)的關(guān)鍵酶——葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)的活性正常。對G6PD的研究早在上世紀(jì)80年代就已進入DNA水平，研究主要集中在G6PD缺乏癥基因突變方面。近年來，美國哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院Joslin糖尿病中心研究發(fā)現(xiàn)G6PD與

5、糖尿病腎病、血管內(nèi)皮細(xì)胞功能等均存在密切聯(lián)系。目前認(rèn)為，G6PD不僅與白細(xì)胞呼吸爆發(fā)功能，與糖尿病及其并發(fā)癥均存在密切關(guān)系。 本研究將采用含不同濃度葡萄糖培養(yǎng)液離體培養(yǎng)的健康成人外周血白細(xì)胞及符合ADA 1997年診斷標(biāo)準(zhǔn)的糖尿病患者外周血白細(xì)胞作為研究對象，觀察細(xì)胞周圍環(huán)境中葡萄糖濃度對其呼吸爆發(fā)功能的影響。 研究分為以下兩部分進行： 第一章不同濃度葡萄糖培養(yǎng)正常人離體白細(xì)胞的呼吸爆發(fā)功能研究 【目的】

6、 探討正常人離體外周血白細(xì)胞經(jīng)不同葡萄糖濃度培養(yǎng)后，在不同時間點，白細(xì)胞內(nèi)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)活性的改變，及其對白細(xì)胞呼吸爆發(fā)功能的影響。 【方法】 1．以分離出來的健康成人外周血白細(xì)胞為實驗對象，分別用5mM，15mM，25mM濃度的D-葡萄糖培養(yǎng)液培養(yǎng)(5mM組、15mM組、25raM組)，20mML-葡萄糖+5mM D-葡萄糖培養(yǎng)為高滲對照組(L-GLU組)，每組6例。2．分別在10min、2

7、0min、30min、1h、2h、4h、8h、12h、24h共9個不同的培養(yǎng)時間點，用分光光度法檢測白細(xì)胞內(nèi)G6PD的活性及NADPH的含量，用熒光探針法檢測細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)量。 3．實驗數(shù)據(jù)計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。采用SPSS10.0軟件進行統(tǒng)計分析，采用連續(xù)性重復(fù)測量的方差分析。同時考慮處理分組和重復(fù)測量的時間點兩個因素，同時兼顧主效應(yīng)和交互效應(yīng)的影響。檢驗標(biāo)準(zhǔn)α定為0.05。 【結(jié)果】 1．正常

8、人白細(xì)胞G6PD活性及NADPH含量在不同濃度葡萄糖培養(yǎng)時均表現(xiàn)為早期相(即10min、ZOmin、30min、1h和2h五個時間點)無顯著變化。25mM組在培養(yǎng)4h時開始出現(xiàn)G6PD活性及NADPH含量的下降，15mM組在培養(yǎng)8h時出現(xiàn)下降，均與培養(yǎng)時間呈負(fù)相關(guān)(分別為r=-0.803 P<0.001 N=54和r=-0.879 P<0.001 N=54)。5mM組及L-GLU組均未見G6PD活性及NADPH含量隨時間的改變。

9、 2．從4h時間點開始，25mM組的G6PD活性 NADPH含量與15mM組、5mM組及L-GLU組相比，均存在顯著差異(P<0.01)。從8h時間點開始，15mM組的G6PD活性及NADPH含量與25mM組、5mM組及L-GLU組相比，差異顯著(P<0.01)。 3．除L-GLU組外，不同濃度葡萄糖組在培養(yǎng)10min、20min、30min時白細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)量隨培養(yǎng)液葡萄糖濃度的升高而增加。從1h時間點開始，15mM組及25m

10、M組白細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)量均隨著NADPH的含量及G6PD活性的下降而降低。5mM組及L-GLU組G6PD活性、NADPH含量及ROS產(chǎn)量均無明顯改變(P>0.05)。 4．四組的NADPH含量與G6PD活性均呈正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為(r=0.690 P<0.001 N=54)、(r=0.868 P<0.001 N=54)、(r=0.870 P<0.001N=54)、(r=0.803 P<0.001 N=54)。 【結(jié)論

11、】 1．高糖的培養(yǎng)環(huán)境對離體培養(yǎng)的白細(xì)胞是一個刺激因素，葡萄糖濃度越高對白細(xì)胞呼吸爆發(fā)的影響越明顯。在刺激早期G6PD活性無改變，細(xì)胞ROS產(chǎn)量隨著刺激強度的加大而增加。 2．持續(xù)的高糖刺激可明顯降低白細(xì)胞G6PD活性，影響NADPH的產(chǎn)量。 3．白細(xì)胞NADPH含量與G6PD活性的變化一致，并直接影響ROS產(chǎn)量，影響呼吸爆發(fā)功能的發(fā)揮。 【目的】 第二章糖尿病患者外周血白細(xì)胞呼吸爆發(fā)功能研究檢測

12、在不同的血糖控制情況下，2型糖尿病患者外周血白細(xì)胞的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)活性、G6PDmRNA表達及白細(xì)胞呼吸爆發(fā)功能的變化。對G6PD與糖尿病白細(xì)胞呼吸爆發(fā)功能改變的關(guān)系和可能機制進行初步探討。 【方法】 1．以符合WHO 1997年診斷標(biāo)準(zhǔn)的2型糖尿病患者20例為研究對象，按糖化血紅蛋白水平分為兩個亞組，HbAlc≤7.0％(G1組)和HbAlc>7.0％(G2組)；健康成年人10例為對照組(NC組)。

13、 2．分離外周血白細(xì)胞，用分光光度法檢測白細(xì)胞內(nèi)的G6PD活性、NADPH含量；用熒光探針法測定ROS的含量；用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測白細(xì)胞G6PDmRNA。 3．實驗數(shù)據(jù)計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。采用SPSS10.0軟件進行統(tǒng)計分析。兩樣本計量資料比較采用t檢驗。多組間資料比較用單因素方差分析(one-way ANOVA)。檢驗標(biāo)準(zhǔn)α定為0.05。 【結(jié)果】 1．G1組患者外

14、周血白細(xì)胞G6PD活性、NADPH及RoS含量與正常對照組相比均顯著下降(P<0.01)。 2．G2組白細(xì)胞G6PD活性、NADPH及ROS含量與G1組相比呈進一步下降，差異顯著(P<0.01)。 3．相關(guān)性分析：白細(xì)胞G6PD活性、NADPH及ROS含量均與HbAlc水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0．757 P<0.01 n=30)(r=-0.671 P<0.01 n=30)(r=-0.814 P<0.01 n=30)。

15、 4．外周血白細(xì)胞G6PDmRNA表達水平G2組最高。G1組和G2組分別與NC組相比，均差異顯著(P<0.01)，G1組與G2組相比亦呈顯著差異(P<0.01)。 【結(jié)論】 1．與健康成人相比，2型糖尿病患者外周血白細(xì)胞G6PD活性、NADPH及ROS含量均明顯降低，提示2型糖尿病患者白細(xì)胞呼吸爆發(fā)功能障礙，與其G6PD活性降低有關(guān)。 2．2型糖尿病患者中，血糖控制不佳的患者與血糖控制良好的患者相比，其G6PD活