外周血平滑肌祖細胞與2型糖尿病的相關性研究.pdf

1、背景與目的：
　　隨著近年來我國經濟的發(fā)展，人民生活水平提高，2型糖尿病的發(fā)病率也迅速升高。作為一種慢性代謝性疾病，患者常表現為糖、脂等物質的代謝紊亂。但其最主要的致殘和致死原因是并發(fā)的大血管疾病。多個研究也顯示，糖尿病患者的冠心病發(fā)病率明顯高于非糖尿病患者。近年來研究發(fā)現，在冠心病等大血管疾病的發(fā)生和發(fā)展中，血管平滑肌祖細胞（smooth muscle progenitor cells,SPCs）發(fā)揮了十分重要的作用。
　

2、　SPCs是一類能增殖并分化為平滑肌細胞的前體細胞，存在于骨髓、外周血及血管外膜等多個組織器官中。其中分布于外周循環(huán)血的SPCs主要表達CD14+/CD105+。有研究表明，在多種心血管危險因素的影響下，血管內膜受到損傷，局部組織細胞通過釋放趨化因子和細胞因子能動員骨髓中的SPCs進入外周循環(huán)血，并歸巢于受損血管段，參與新生內膜的形成，最終導致動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展。然而，對于SPCs與2型糖尿病患者心血管并發(fā)癥間的關聯(lián)性卻知之甚少。

3、
　　本研究旨在通過觀察2型糖尿病患者外周血平滑肌祖細胞數量的變化特點，揭示其在體內的影響因素。此外，通過體外實驗觀察高糖對SPCs的功能影響，為進一步探索糖尿病患者發(fā)生心血管并發(fā)癥的機制奠定基礎。
　　實驗方法：
　　第一部分：成人外周血SPCs的體外分離及誘導分化。無菌條件下，采集成人外周血，應用密度梯度離心法分離獲得單個核細胞，接種到含有血小板源性生長因子（platelet-derived growth fact

4、or-BB，PDGF-BB）和堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）的培養(yǎng)基中進行誘導擴增，12d后利用流式細胞儀分析貼壁細胞中SPCs的含量并分選純化，繼續(xù)在轉移生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）的作用下誘導分化。倒置顯微鏡觀察SPCs在增殖、分化過程中的形態(tài)變化，免疫熒光染色法觀察其平滑肌肌動蛋白-α（α-smooth

5、muscleactin,α-SMA）的表達，同時應用Western blot技術檢測調寧蛋白和平滑肌肌球蛋白重鏈（smooth muscle myosin heavy chain，SM-MHC）的表達情況。
　　第二部分：統(tǒng)計分析外周血中SPCs數量的變化及相關因素。選擇2010年1月至2011年1月在西京醫(yī)院心血管內科診治的2型糖尿病患者35例及20名健康志愿者。分為：單純性2型糖尿病組（DM組，n=20）、2型糖尿病伴冠心病組

6、（DM+CAD組，n=15）和健康對照組（Con組，n=20）。應用流式細胞儀對外周血SPCs行計數分析，同時檢測空腹血糖（FPG）、糖化血紅蛋白（HbA1c）、收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）及高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）等臨床指標。通過多元線性逐步回歸法分析外周血SPCs數量與各臨床指標的相關性。
　　第三部分：不同濃度葡萄糖對SPCs功能的影響。分離

7、外周血單個核細胞，進行誘導擴增后應用流式細胞分選儀獲得SPCs。隨機分為5組給予不同濃度葡萄糖干預：對照組(5.5mmol/L)，11mmol/L組，22mmol/L組，44mmol/L組和滲透壓對照組（5.5mmol/L葡萄糖+38mmol/L甘露醇）。分別用MTT比色法，Transwell小室遷移實驗以及粘附能力測定實驗檢測各組干預6天后，SPCs增殖、遷移和粘附能力的變化。此外，培養(yǎng)SPCs8天，期間用22mmol/L葡萄糖分別干

8、預0、2、4、8天，觀察各組細胞增殖、遷移和粘附能力的變化。
　　實驗結果：
　　1．成人外周血單個核細胞誘導培養(yǎng)4d時開始出現細胞集落，12d時細胞呈明顯梭形。流式細胞儀分析顯示，CD14+/CD105+的SPCs占貼壁細胞的（71.8±7.2）％。經分選純化后的SPCs培養(yǎng)到28d呈旋渦狀生長。間接免疫熒光染色顯示，α-SMA表達呈陽性。Westernblot檢測顯示，調寧蛋白和SM-MHC分別于14，21d開始表達，并

9、逐漸增加。
　　2．單純性2型糖尿病患者外周血中SPCs數量明顯高于健康對照組（26.20±11.36vs.14.30±7.61，P＜0.05），而2型糖尿病伴冠心病組又明顯高于單純2型糖尿病組（42.00±8.93vs.26.20±11.36，P＜0.05）。多元線性逐步回歸分析顯示：HbA1c、SBP、HDL-C是影響成人外周血SPCs數量的獨立相關因素。其回歸方程為y=13.433＋2.435x2－21.625x8＋0.18

10、8x3。Spearman相關分析顯示：外周血SPCs數量與HbA1c、SBP呈明顯正相關（r=0.684,r=0.379,P＜0.01）,而與HDL-C呈明顯負相關（r=-0.654,P＜0.01）。
　　3．在高糖干預實驗中，與對照組相比，高糖各組均能明顯促進外周血SPCs的增殖、遷移和粘附能力，其中22mmol/L葡萄糖組的影響最為顯著，44mmol/L葡萄糖組的促進作用有所下降（P＜0.05）。用22mmol/L葡萄糖分別干

11、預SPCs0、2、4、8天，其增殖、遷移和粘附能力隨著作用時間延長而增強，以干預8天組最顯著（P＜0.05）。
　　結論：
　　1．通過對成人外周血單個核細胞的誘導擴增，可以獲得表達CD14+/CD105+的SPCs，并證實了SPCs具有向平滑肌細胞進一步分化的能力；
　　2．2型糖尿病患者體內糖、脂代謝紊亂可能導致外周血SPCs數量升高，從而促進冠心病的發(fā)生和發(fā)展。HbA1c、SBP、HDL-C作為獨立相關因素，可能