中樞神經(jīng)特異性RNA結(jié)合蛋白NOVA1在肝癌中的表達及其促進腫瘤發(fā)展的潛在分子機制探究.pdf

1、原發(fā)性肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC，以下簡稱肝癌)是全世界排名第六位的最常見惡性腫瘤，其發(fā)病率正逐年上升。雖然腫瘤切除及肝移植大大提高了早期肝癌患者的生存率，但是高復發(fā)風險仍然危害著患者的預后健康，術(shù)后5年內(nèi)仍有50％-70％復發(fā)率。因此，深入研究肝癌的轉(zhuǎn)移和復發(fā)機制，通過機制的研究來探尋有效的對抗轉(zhuǎn)移和復發(fā)的治療，已經(jīng)成為現(xiàn)今肝癌防治以及預防術(shù)后復發(fā)的重點之一。腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移是一個多步

2、驟的復雜動態(tài)過程。包括染色體水平的改變，癌基因表達的增加，抑癌基因的失活，與肝癌轉(zhuǎn)移復發(fā)相關(guān)的細胞因子、受體及粘附分子的表達，某些信號通路的改變等。許多研究已經(jīng)證明某些癌基因的表達增加與肝癌發(fā)生發(fā)展及不良預后有著明顯關(guān)系。
　　腫瘤神經(jīng)腹側(cè)抗原-1(Neuro-oncological ventral antigen-1，No va1)基因是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)特異性的RNA結(jié)合蛋白。其作為一種神經(jīng)系統(tǒng)的自身抗原，首先在副腫瘤性斜視眼陣

3、攣-肌陣攣共濟失調(diào)(Paraneoplastic Opsoclonus-Myoclonus Ataxia,POMA)患者中被發(fā)現(xiàn)。一些研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Nova1在惡性腫瘤細胞中有表達。但至今未有研究報道關(guān)于Nova1在肝細胞肝癌中的表達。
　　本研究探討了Nova1在人肝癌組織中的表達情況及同時通過各種體內(nèi)體外實驗了解Nova1基因在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的臨床意義和潛在作用機制，初步證明Nova1基因是肝癌發(fā)生相關(guān)的新的易感基因。

4、　　本研究分為三部分:
　　第一部分 Nova1在人肝癌組織中的表達及與患者臨床病理特征的關(guān)系我們采用免疫組化法檢測了Nova1在91例肝癌組織和配對癌旁組織中的表達，同時我們隨機選取了四對肝癌和癌旁組織，提取組織蛋白后通過免疫印跡法檢測Nova1蛋白表達量。免疫組化及免疫印跡法均提示Nova1在肝癌組織中的表達水平高于配對癌旁組織。進一步結(jié)合臨床隨訪資料后發(fā)現(xiàn)肝癌組織Nova1陽性表達是影響總生存率(Overall surviv

5、al rate，OS)、至復發(fā)生存率(Time to recurrencerate，TTR)、早期復發(fā)的獨立危險因素。Kaplan-Meier生存曲線顯示，癌內(nèi)高表達Nova1的患者OS和TTR要顯著低于低表達組。而癌旁Nova1高表達患者OS和TTR與低表達患者相比無明顯差異。這一部分研究提示，Nova1可能與HCC患者預后相關(guān)，在HCC的轉(zhuǎn)移復發(fā)中起一定作用。
　　第二部分 Nova1誘導型表達載體的構(gòu)建及體外對肝癌細胞生物學

6、行為的影響第二部分中，我們進一步構(gòu)建和驗證了Nova1干擾和過表達的誘導型載體的單克隆細胞株。誘導型表達載體是通過強力霉素(Doxycycline，Dox)來誘導基因的過表達和下調(diào)。隨后通過一系列體外細胞功能實驗，進一步證實了與對照組相比，Nova1下調(diào)后，其肝癌細胞的遷移和侵襲能力能明顯減弱;另一組，過表達Nova1后細胞增殖和遷移能力相比于對照組明顯增強。提示Nova1可能是通過調(diào)控肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力，從而促進了肝癌細胞

7、的增殖及術(shù)后的復發(fā)。
　　第三部分體內(nèi)Nova1對肝癌細胞生物學行為的影響及其促進肝癌發(fā)展的潛在機制探討
　　第三部分中，我們首先行裸鼠體內(nèi)皮下成瘤實驗。實驗組裸鼠給予Dox加入飲用水中濃度為1mg/ml;對照組正常飲食不加Dox。實驗結(jié)果提示，Nova1過表達對肝癌腫瘤具有促進生長的作用，而相反下調(diào)Nova1能夠抑制肝癌腫瘤生長。進一步查閱相關(guān)文獻，我們選擇Nova1參與的可變剪接GABAA受體γ2(GABAARγ2)進行

8、深入研究。免疫組化及Western blot檢驗發(fā)現(xiàn)Nova1表達下調(diào)的同時，GABAARγ2存在表達上調(diào)，而相反的Nova1過表達后，GABAARγ2表達下調(diào);GABA的表達量與GABAARγ2的表達量呈現(xiàn)相同的趨勢。免疫共沉淀提示Nova1與GABAARγ2不僅僅在中樞神經(jīng)系統(tǒng)存在相互作用，在外周腫瘤組織中同樣存在相互作用。我們猜想，肝腫瘤細胞異位表達的Nova1，通過下調(diào)GABAARγ2的表達，進一步使得GABAARγ2介導的氯離