肝細胞中結(jié)合丙型肝炎病毒C區(qū)RNA的特異性蛋白分子篩選、鑒定和表達研究.pdf

1、目的和意義: 丙型肝炎病毒（HCV）是慢性肝炎和肝癌的主要病原體之一，但對于HCV 的復制和致病機制目前還是不甚清楚。宿主細胞中的許多蛋白分子可以通過與HCV RNA 基因組的相互作用，調(diào)節(jié)HCV 的翻譯、復制和病毒的組裝。 現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)的HCV RNA 結(jié)合蛋白，其結(jié)合區(qū)域主要位于HCV RNA 的5’-UTR、3’-UTR 和RNA 的副鏈。但是與HCV CORE 區(qū)（核心區(qū)）RNA 結(jié)合的細胞蛋白卻很少有研究報導

2、。本研究擬采用凝膠遷移和紫外交聯(lián)的實驗方法，從人肝癌細胞系HepG2 細胞中初步篩選與HCV CORE 區(qū)RNA 結(jié)合的細胞蛋白分子，確定其與HCV RNA 結(jié)合的具體區(qū)域，并對RNA 結(jié)合蛋白進行分離、鑒定。通過研究宿主細胞蛋白與HCV C 區(qū)RNA 的相互作用，將有助于我們對宿主和病毒相互作用的更好理解，從而在細胞蛋白質(zhì)水平對病毒RNA 的翻譯、復制和病毒蛋白表達進行調(diào)控；并有利于在丙型肝炎的預防和治療方面提出針對性的措施。

3、 方法: ①采用RT-PCR擴增HCV C 區(qū)cDNA序列，并構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEM-HCV；以pGEM-HCV 為模板，采用體外轉(zhuǎn)錄的方法制備DIG 標記和未標記的HCVC-RNA 分子；將DIG 標記的HCV C-RNA 與HepG2 細胞蛋白結(jié)合，進行凝膠遷移實驗；將DIG 標記的HCV C-RNA 與HepG2 細胞蛋白結(jié)合，進行紫外交聯(lián)篩選實驗，并采用未標記的HCV C-RNA 分子進行競爭性實驗；電泳后將RNA/蛋白

4、轉(zhuǎn)移至NC 膜，以DIG 抗體檢測NC 膜上的DIG 信號，判斷是否有細胞蛋白與HCV C-RNA 結(jié)合。 ②采用PCR、克隆和體外轉(zhuǎn)錄的方法，制備不同長度的HCV C-RNA 分子；分別將不同長度的HCV C-RNA 分子與細胞蛋白進行結(jié)合反應(yīng)和紫外交聯(lián)實驗，確定HCV C-RNA 與細胞蛋白的結(jié)合區(qū)域；采用抗-DIG 和免疫沉淀方法，從RNA 和蛋白混合物中，分離與DIG 標記的HCV C-RNA 分子結(jié)合的細胞蛋白；通過

5、SDS-PAGE 和NC 膜的檢測結(jié)果的比對，切取目的蛋白條帶，進行肽指紋圖譜分析鑒定。 ③提取HepG2 細胞總RNA，以RT-PCR 方法擴增PGAM-B 的全基因片斷，與載體pcDNA?3.1/V5-HisA 連接，構(gòu)建真核表達質(zhì)粒pcDNA-PGAM； 以PCR 方法擴增pGEM-HCV 中HCV 核心蛋白基因片斷，與載體pcDNA3.0連接，構(gòu)建真核表達質(zhì)粒pcDNA-HCV；經(jīng)酶切和測序鑒定后，將真核表達

6、質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HepG2 細胞；以免疫細胞化學的方法，在細胞爬片上分別檢測細胞中PGAM-His 蛋白和HCV 核心蛋白的瞬時表達情況。 結(jié)果: ①從1 例HCV 感染者血清中擴增得到的503bp HCV cDNA 序列，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pGEM-HCV，并進行了PCR、酶切鑒定和測序鑒定。②所得HCVcDNA 序列與已知HCV 序列（AB092962.1）比較，屬于HCV 1 型基因C 區(qū)，僅有兩個核苷酸不同，nt 67

7、（23aaK→E）和nt 177（沉默突變），其余序列均一致。③通過凝膠遷移實驗初步檢測到，有HepG2 細胞蛋白與HCV C-RNA分子結(jié)合。④通過紫外交聯(lián)實驗檢測到，有多個HepG2 細胞蛋白與HCVC-RNA 分子在體外發(fā)生了結(jié)合；隨著結(jié)合反應(yīng)體系中細胞蛋白濃度的增加，HCV C-RNA 和蛋白的結(jié)合量隨之增多；未標記HCV C-RNA 對DIG 標記的HCV C-RNA 與HepG2 細胞蛋白的結(jié)合有競爭性抑制作用。⑤3 個不同

8、長度的HCV C-RNA 分子（198nt、306nt 和503nt）都可與HepG2 細胞蛋白在體外發(fā)生結(jié)合；其中C-RNA 5’端的C198 RNA 與細胞蛋白的結(jié)合條帶，最為清晰和銳利。⑥經(jīng)免疫沉淀后的蛋白，在NC 膜上可以檢測到4 條明顯的蘭紫色RNA 結(jié)合蛋白帶；其中以P30 蛋白條帶最為清晰，蛋白量最多。⑦從SDS-PAGE 膠上切取了P30 蛋白條帶，經(jīng)肽指紋圖譜分析鑒定，P30 蛋白為磷酸甘油酸變位酶1（PGAM-B）。

9、⑧從HepG2 細胞中，擴增得到了約為760bp的PGAM-B 的cDNA 全基因片斷；所得PGAM-B 基因序列與已知PGAM-B基因序列（J04173）進行比較，完全一致。⑨基因序列和蛋白讀碼框均正確的真核表達質(zhì)粒pcDNA-PGAM 和pcDNA-HCV，分別轉(zhuǎn)染HepG2 細胞后，可在細胞爬片上檢測到PGAM-His 和HCV 核心蛋白的瞬時表達。 結(jié)論: ①在HepG2 細胞中，有多個細胞蛋白分子可以與HCV