二代測序技術(shù)在t(821)AML中的應(yīng)用及Ezh1促進(jìn)白血病的作用研究.pdf

1、第一部分二代外顯子測序技術(shù)在t(8;21)AML的應(yīng)用
　　目的:二代外顯子測序技術(shù)是腫瘤研究進(jìn)展的一個(gè)里程碑，通過二代外顯子測學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)的基因突變，對了解急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)發(fā)病機(jī)制和指導(dǎo)治療分層有重要意義。t(8;21)(q22;q22)易位是AML中最常見的細(xì)胞遺傳學(xué)改變，t(8;21)AML易位產(chǎn)生AML1-ETO融合基因，AML1-ETO單獨(dú)表達(dá)不能引起白血病，需與其它基

2、因突變共同作用才能引起AML。相比其它類型AML，t(8;21)AML更容易發(fā)生重現(xiàn)性基因突變，因此篩選該類疾病中新的突變非常重要。根據(jù)NCCN-2015-AML-V1預(yù)后分層，t(8;21)AML或合并KIT以外突變，均預(yù)后良好;1/3的患者合并KIT突變，預(yù)后中等。但是從臨床流行病學(xué)角度分析，t(8;21)AML是一類異質(zhì)性較大的白血病，原因尚不明確。因此篩選t(8;21)AML的突變基因?qū)τ谖磥砑膊》謱泳哂惺种匾囊饬x。本研究目

3、的是:二代外顯子測序技術(shù)在白血病中的應(yīng)用價(jià)值，發(fā)現(xiàn)初治t(8;21)AML和復(fù)發(fā)基因突變分布規(guī)律，初治和復(fù)發(fā)的克隆演變。
　　方法:我們設(shè)計(jì)的NimbleGen捕獲芯片，覆蓋了下列111個(gè)基因外顯子區(qū)域:WHO-2008年指南和NCCN-2014年指南中有關(guān)AML的突變基因，基礎(chǔ)研究已證實(shí)與AML相關(guān)的始動突變基因和已有芯片的所覆蓋的突變基因。部分基因覆蓋全部的外顯子區(qū)域。用Kasumi-1和SKNO-1預(yù)混不同細(xì)胞比例評估二代外

4、顯子芯片技術(shù)的檢測敏感性。NimbelGen捕獲芯片的測序平臺是Illumina Hiseq，檢測了33例t(8;21)AML骨髓樣本;用Varscan2方法，采用初治-緩解和復(fù)發(fā)-緩解配對分析策略，得到初治以及復(fù)發(fā)的突變，再根據(jù)79例正常人數(shù)據(jù)庫以及其他方式篩選得到有害性突變并篩選重現(xiàn)性突變。
　　結(jié)果:我們用Kasumi-1和K562兩種細(xì)胞系按一定比例預(yù)混后，進(jìn)行敏感性分析。在1600×的深度下，3％的混合濃度下，純合突變的

5、檢出率為100％，雜合突的檢出率大于95％。分析18例t(8;21)AML突變情況，突變頻率最高的是KIT，其次是ASXL1、FLT3、KDM6A、NRAS、PHF6和RAD21-AS1。初治的基因突變包括:PHF6、KDM6A、FLT3、SH2B3、RAD21、MEF2B、IDH2、IDH1、CBL和ETV6。復(fù)發(fā)的基因突變包括:SETD2、IKZF1、FLT3-ITD。初治和復(fù)發(fā)共有的突變基因包括:KIT、RAD21-AS1、NRA

6、S、ASXL1。在18例t(8;21)AML樣本中，有3個(gè)樣本是成對的，＃1-初治合并的突變是NRAS和FLT3，＃1-復(fù)發(fā)合并的突變是FLT3-ITD;＃2-初治FLT3，＃2-復(fù)發(fā)合并的突變是NRAS和IKZF1，推測＃1和＃2患者可能存在克隆演變。＃7-初治和＃7-復(fù)發(fā)均為KIT突變，推測＃7患者的復(fù)發(fā)是原白血病主克隆復(fù)發(fā)。
　　結(jié)論:用二代白血病外顯子芯片檢測敏感性高，在t(8;21)AML中，發(fā)現(xiàn)除KIT以外的基因突變，

7、初步探索了初治和復(fù)發(fā)的基因突變，有助于分析疾病的克隆演變。
　　第二部分 Ezh1促進(jìn)t(8;21)AML發(fā)病機(jī)理研究
　　目的:急性髓系白血病是一類異質(zhì)性血液系統(tǒng)疾病，其發(fā)生和發(fā)展與造血干細(xì)胞的成熟分化障礙、惡性克隆有關(guān)。t(8;21)(q22;q22)易位是AML中最常見的細(xì)胞遺傳學(xué)改變，其易位形成AML1-ETO融合基因，轉(zhuǎn)錄翻譯為AML1-ETO融合蛋白。盡管該類白血病均攜帶t(8;21)(q22;q22)易位，具有

8、相對均一的遺傳學(xué)背景，但該型白血病本身存在非常強(qiáng)的異質(zhì)性。造成異質(zhì)性較大的根本原因在于研究機(jī)制不清楚。表觀遺傳因素參與AML1-ETO陽性白血病發(fā)生發(fā)展:ETO募集轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物N-CoR/SMRT/Sin3/HDAC，抑制下游基因的表達(dá);AML1-ETO與其他轉(zhuǎn)錄因子(例如:CEBPα、PU.1和MEF)通過相互作用而抑制或激活下游基因的表達(dá);PRMT1甲基化AML1-ETO9a融合蛋白142位精氨酸，促進(jìn)Kasumi-1細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄

9、激活。乙?；疉ML1-ETO融合蛋白43位賴氨酸，促進(jìn)白血病細(xì)胞的自我更新。組蛋白甲基化在該型白血病中的作用尚沒有報(bào)道。生物信息學(xué)TCGA表達(dá)譜芯片提示Ezh1(Enhancer ofzeste homolog1)在t(8;21)AML中表達(dá)高于正常核型AML，Ezh1維持造血干細(xì)胞多能性，Ezh1敲除骨髓呈衰竭狀態(tài)。揭示了Ezh1與造血系統(tǒng)的重要聯(lián)系，Ezh1在白血病中的作用尚不明確。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖翘接慐zh1與AML1-ETO的關(guān)系，

10、Ezh1在t(8;21)AML中的生物學(xué)功能。
　　方法:實(shí)時(shí)定量PCR(Real-Time Quantitative PCR)檢測Ezh1的mRNA表達(dá)水平;Western blot檢測Ezh1的蛋白表達(dá)水平。免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation，CoIP)和Western blot實(shí)驗(yàn)檢測AML1-ETO和Ezh1是否相互結(jié)合。轉(zhuǎn)染siRNA沉默EZH1，流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率，克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖情況

11、。為了研究Ezh1在體內(nèi)的功能，裸鼠皮下注射轉(zhuǎn)染空載體的SKNO-1細(xì)胞和轉(zhuǎn)染siRNA48h的SKNO-1細(xì)胞，觀察腫瘤體積、重量和白血病骨髓、肺、肝和脾浸潤情況。
　　結(jié)果:Ezh1在t(8;21)AML的細(xì)胞系和患者中mRNA和蛋白水平特異性高表達(dá)，AML1-ETO與Ezh1結(jié)合形成相互作用復(fù)合物。在Kasumi-1和SKNO-1細(xì)胞中，用siRNA沉默Ezh1的表達(dá)后克隆數(shù)目形成減少。在裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組注射轉(zhuǎn)染siE

12、zh148h的SKNO-1細(xì)胞，對照組注射轉(zhuǎn)染空載體48h的SKNO-1細(xì)胞，每組6只。在成瘤速度上對照組在24天可以測到腫瘤大小，siEzh1組腫瘤在第45天可以測到腫瘤大小。siEzh1組的腫瘤體積和成瘤速度明顯小于和慢于空載組。siEzh1組vs對照組腫瘤重量:68±23mg vs262±64 mg，P＜0.05，兩組腫瘤重量有明顯差異，siEzh1組腫瘤明顯小于空載組。siEzh1組骨髓形態(tài)和病理切片，低倍鏡觀察siEzh1組白