人臍帶間充質(zhì)干細胞初始接種密度對成骨誘導(dǎo)分化影響的初步研究.pdf

1、目的：研究人臍帶間充質(zhì)干細胞的體外分離、原代培養(yǎng)，擴增純化、流式細胞儀細胞表型鑒定，以及對人臍帶間充質(zhì)干細胞初始接種密度對成骨誘導(dǎo)分化影響等生物特性的初步研究，為人臍帶間充質(zhì)干細胞組織工程研究進一步動物實驗及臨床研究提供理論基礎(chǔ)。
　　 方法：⑴取材無菌條件下取湘雅醫(yī)院手術(shù)室婦產(chǎn)科健康孕婦足月剖腹產(chǎn)臍帶組織標(biāo)本15份，于手術(shù)室內(nèi)無菌條件下解剖去除臍帶動靜脈，無菌PBS洗去積血，放入事先準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基送至湘雅醫(yī)院中心實驗室細胞房備

2、用。⑵人臍帶間充質(zhì)干細胞的原代細胞培養(yǎng)、鑒定：在無菌操作臺內(nèi)將準(zhǔn)備好的臍帶組織剪碎至1mm3組織塊，采用Ⅱ型膠原蛋白酶消化法培養(yǎng)原代細胞。待原代細胞培養(yǎng)成功，流式細胞技術(shù)鑒定細胞表型。⑶人臍帶間充質(zhì)干細胞傳代培養(yǎng)，及其生長曲線繪制。原代細胞培養(yǎng)、并鑒定后，傳代培養(yǎng)至第3代時，采用臺盼藍染色記數(shù)活細胞數(shù)量，記錄結(jié)果，以時間為橫坐標(biāo)，活細胞數(shù)為縱坐標(biāo)繪制細胞生長曲線。⑷不同細胞接種密度人臍帶間充質(zhì)干細胞擴增培養(yǎng)：將第3代細胞以三種不同接種密

3、度(1×105/ml，1×106/ml，1×107/ml)進行擴增培養(yǎng)18天，其中每種細胞長滿后，記錄每組收獲細胞總數(shù)量及培養(yǎng)時間分別繪制生長曲線。⑸初始接種細胞密度對人臍帶間充質(zhì)干細胞成骨誘導(dǎo)分化的作用研究：將第3代細胞按前述三種接種密度分組接種至細胞培養(yǎng)板進行成骨誘導(dǎo)分化實驗，本實驗采用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液含1.0×10-7mol/L地塞米松，50mg/L抗壞血酸，50mg/L維生素C，1.0×10-3mol/Lβ-甘油磷酸鈉及DMEM/

4、高糖培養(yǎng)基。鑒定誘導(dǎo)分化后成骨細胞采用(1)堿性磷酸酶試劑盒染色法。所有結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，用SPSS.17.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，組間差異性比較在方差齊性檢驗后，采用單因素方差分析(ANOVA-LSD)。檢驗水準(zhǔn)為α=0.05，P<0.05認為有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：①來源于人臍帶Wharton’s jelly膠的單個核細胞經(jīng)體外培養(yǎng)貼壁后表現(xiàn)為間充質(zhì)樣的細胞，間充質(zhì)細胞呈成纖維樣細胞形態(tài)。②第3，5

5、，7代細胞生長曲線基本相同。生長共同特性：細胞接種后24小時內(nèi)貼壁，傳代培養(yǎng)潛伏期約為24-36小時；傳代培養(yǎng)對數(shù)增殖期約為3-5天，在該階段細胞生長活躍，增勢迅速，持續(xù)4～5d；對數(shù)增殖期結(jié)束后4-5天，細胞生長進入平臺期。③表達間充質(zhì)干細胞相關(guān)的抗原CD105，CD44，不表達造血干細胞抗原CD34，CD45，與源于骨髓的間充質(zhì)干細胞一致，只是來源不同。④不同初始接種密度人臍帶間充質(zhì)干細胞向成骨誘導(dǎo)分化差異顯著(p<0.05)，1×