中長鏈脂肪酸對胰島素抵抗及糖脂代謝通路LXRα,ChREBP及Elovl6的影響.pdf

1、前言：
　　胰島素抵抗是2型糖尿病的主要病理生理特征之一，也是早期2型糖尿病最有效的預(yù)測因子。肥胖引起的胰島素抵抗是2型糖尿病的主要危險因素。近年來，流行病學(xué)研究調(diào)查發(fā)現(xiàn)脂肪酸鏈長度及飽和程度不同的脂肪酸對人體代謝作用的影響不同，如攝入過量的碳水化合物和長鏈飽和脂肪酸(LCFA)可使體內(nèi)脂質(zhì)積聚引起脂毒性，導(dǎo)致骨骼肌、脂肪組織和肝臟的胰島素抵抗;而長鏈多不飽和脂肪酸(PUFA)飲食可抑制葡萄糖和脂肪的生成，減少脂質(zhì)積聚，對心血管疾

2、病、胰島素抵抗和糖尿病等具有防御作用;中鏈飽和脂肪酸(MCFA)，可明顯減少肥胖患者的腹圍，有效改善腹部肥胖，并且不引起血脂異常。這些研究表明脂肪酸成分的組成是調(diào)節(jié)胰島素敏感性新的決定因素。因此，在飲食誘導(dǎo)的肥胖和胰島素抵抗研究中，不同脂肪酸飲食組成與基因調(diào)控之間的相互作用成為近年研究的熱點。
　　近年來研究發(fā)現(xiàn)，在哺乳動物中還存在一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜結(jié)合酶——長鏈脂肪酸延長酶6(Elov16)，是脂肪酸合成酶的新成員。研究顯示靶向Elo

3、v16敲除(Elov16-/-)小鼠可避免高脂飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗，引起脂肪酸組成和比例的改變，其胰島素敏感性的恢復(fù)與肝臟IRS-2/Akt和DAG/PKC信號通路有關(guān)。這些數(shù)據(jù)表明Elov16可能是胰島素抵抗、糖尿病、心血管疾病及其他代謝疾病治療的潛在靶點。但是，其它途徑是否也參與了Elov16-/-小鼠高脂飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗的調(diào)節(jié)尚不清楚，有待于進一步研究。
　　肝X受體(LXR)、固醇調(diào)控元件結(jié)合蛋白(SREBP-1c)、

4、糖類應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(ChREBP)是體內(nèi)脂質(zhì)合成重要的調(diào)節(jié)因子，通過調(diào)節(jié)與脂肪生成相關(guān)酶的基因轉(zhuǎn)錄從而調(diào)控膽固醇、脂肪酸和甘油三酯的合成，在肝臟糖脂代謝中起著重要的作用。SREBP-1c和ChREBP受LXR的直接調(diào)控。SREBP-1c和ChREBP直接調(diào)控Elov16，LXR直接或間接調(diào)控Elov16。因此，在飲食營養(yǎng)調(diào)控水平，研究核轉(zhuǎn)錄因子SREBP-1c、LXR、ChREBP與脂肪生成酶Elov16之間的調(diào)控關(guān)系可能為2型糖尿病

5、治療找到新的藥物靶點，應(yīng)給予重點研究。
　　目前，國外已有少數(shù)研究報道，Elov16和肝糖脂代謝的關(guān)系主要通過SREBP-1c轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)信號通路，但至今為止，國內(nèi)外尚缺乏在LXR和ChREBP調(diào)控水平的研究報道。本研究擬通過建立不同脂肪酸飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗大鼠，從分子水平、組織水平和活體動物實驗，應(yīng)用國內(nèi)外公認(rèn)的評價胰島素抵抗的金標(biāo)準(zhǔn)——高胰島素-正血糖鉗夾試驗結(jié)合氚標(biāo)技術(shù)，首次評價不同脂肪酸飲食組成對肝臟胰島素敏感性的影響，并在

6、LXR和ChREBP調(diào)控水平上探討中長鏈脂肪酸對胰島素抵抗的影響及其可能機制，為糖尿病治療找到新靶點奠定基礎(chǔ)。
　　實驗方法：
　　1、動物模型分組:大鼠隨機分為五組，每組16只。第一組為正常飲食對照組(CON組)，采用AIN-93G配方的標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng);其它四組為高脂高糖飲食組（脂肪來源不同，每組含有一種特定脂肪酸），分別為椰子油組(MCFA組)，主要為中鏈飽和脂肪酸;豬油組(LCFA組)，主要為長鏈飽和脂肪酸;魚油組(n-

7、3 PUFA組)，主要為n-3多不飽和脂肪酸;葵花籽油組(n-6 PUFA組)，主要為n-6多不飽和脂肪酸。8周后，每組大鼠再隨機分為2個亞組:基礎(chǔ)亞組和鉗夾亞組，每組8只。每組分別喂養(yǎng)8周，每周監(jiān)測大鼠體重和采食量。
　　2、大鼠麻醉狀態(tài)下，行頸部動靜脈置管術(shù)，右頸內(nèi)靜脈用于輸液，左頸動脈用于采血。術(shù)后恢復(fù)3天后。
　　3、大鼠清醒狀態(tài)下，行高胰島素-正血糖鉗夾試驗結(jié)合氚標(biāo)技術(shù)評價大鼠肝臟胰島素敏感性。
　　4、采用

8、葡萄糖氧化酶法測定血糖;氚標(biāo)記葡萄糖[6-3H]放射性核素示蹤法檢測葡萄糖消耗量和攝取率;
　　5、ELISA方法測定血漿胰島素;
　　6、采用比色法測定血漿游離脂肪酸(FFA);
　　7、酶法測定血漿甘油三酯(TG)、膽固醇(TC)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)，以及肝臟內(nèi)甘油三酯(TG)、膽固醇(TC)含量;
　　8、Real-time PCR分析方法檢測肝臟和脂肪組織中LXRα、ChREBP、SREBP

9、-1c、Elov16和FAS mRNA表達(dá);
　　9、Western-Blot分析方法檢測肝臟LXRα、ChREBP、Elov16蛋白表達(dá)及胰島素信號傳導(dǎo)過程中相關(guān)信號分子IRS-2、phospho-IRS-2(Ser233)、Akt、phospho-Akt(Ser473)活性;脂肪組織中Elov16蛋白表達(dá)及胰島素信號分子Akt、phospho-Akt(Ser473)活性;
　　10、油紅O染色方法檢測肝臟脂肪滴含量。

10、r>　　結(jié)果：
　　1、四組高脂高糖飲食組中，平均日飼料消耗量以LCFA組和n-6 PUFA組最多，MCFA組和n-3 PUFA組相對較少(P＜0.05)，但四組采食量與CON組相比無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。LCFA組和n-6 PUFA組能量攝入明顯高于MCFA組、n-3 PUFA組、CON組三組。
　　2、整個實驗過程中，以LCFA組和n-6 PUFA組大鼠體重增長較快(P＜0.01，vsCON組)，n-3 PUFA組增長速度較緩

11、慢(P＜0.01，vs CON組)，MCFA組和CON組大鼠體重在統(tǒng)計學(xué)上無顯著差異。實驗結(jié)束時，以LCFA組和n-6 PUFA組大鼠腎周、附睪、皮下脂肪重增長較快，明顯高于其它三組(P＜0.01)。n-3 PUFA組大鼠腎周、附睪、皮下脂肪重增長最慢，甚至低于對照組(P＜0.05)。MCFA組大鼠腎周、附睪、皮下脂肪重與CON組、n-3 PUFA組相比，沒有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　3、四組高脂高糖飲食組中，LCFA組的TG濃度升高最明

12、顯，與MCFA組、n-3PUFA和n-6 PUFA組相比有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01)。TC濃度以LCFA組最明顯(P＜0.05，vs MCFA組、n-3 PUFA組)，其次是n-6 PUFA組，但與LCFA、MCFA、n-3 PUFA三組相比無顯著統(tǒng)計學(xué)差異。四組高脂高糖飲食組中的TG、TC濃度與CON組相比，無顯著統(tǒng)計學(xué)差異。HDL-C濃度以LCFA組下降最多，與其他組相比差異顯著(P＜0.01)。MCFA組、n-3 PUFA組、n-

13、6 PUFA組三組兩兩比較無顯著統(tǒng)計學(xué)差異。
　　4、四組高脂高糖飲食組中，肝臟內(nèi)TG，TC濃度以LCFA組和n-6 PUFA組最高，明顯高于其它三組(P＜0.01)。MCFA組、n-3 PUFA組、CON組三組間相比無顯著統(tǒng)計學(xué)差異。
　　5、在基礎(chǔ)狀態(tài)，與CON組比較，LCFA組血糖濃度升高0.12倍(P＜0.01)，n-6PUFA組血糖略升高約0.07倍，但無統(tǒng)計學(xué)差異。MCFA組、n-3 PUFA組與CON組相比無顯

14、著差異。與MCFA組、n-3 PUFA組相比，LCFA組和n-6 PUFA組血糖明顯升高(P＜0.01)。在鉗夾狀態(tài)，各組血糖無明顯差異。
　　6、在基礎(chǔ)狀態(tài)，與CON組比較，LCFA組和n-6 PUFA組胰島素濃度分別增加了0.83倍和0.48倍(P＜0.01)。MCFA組、n-3 PUFA組與CON組相比無顯著差異。
　　7、在基礎(chǔ)狀態(tài)，與CON組比較，LCFA組和n-6 PUFA組游離脂肪酸(FFA)分別增加了0.6倍

15、(P＜0.01)和0.32倍(P＜0.05)。MCFA組和n-3 PUFA組與CON組相比無顯著差異;各處理組的鉗夾組與相應(yīng)基礎(chǔ)組相比，脂肪乳濃度下降(P＜0.01)。
　　8、在高胰島素正血糖鉗夾試驗中，與CON組比較，LCFA組和n-6 PUFA組葡萄糖輸注率(GIR)分別下降了45％和39％(P＜0.01)。LCFA組和n-6 PUFA組的肝臟葡萄糖生成率(HGP)在基礎(chǔ)狀態(tài)和鉗夾狀態(tài)下，與其他組相比均明顯升高(P＜0.01

16、)，而且胰島素誘導(dǎo)的HGP抑制率分別為30％和34％(P＜0.01)。
　　9、四組高脂高糖飲食組中，LCFA組和n-6 PUFA組大鼠胰島素敏感性指數(shù)(ISI)最低(P＜0.01)。MCFA組、n-3 PUFA組、CON組之間無顯著差異。
　　10、LCFA組和n-6 PUFA組肝臟LXRα、ChREBP、SREBP-1c、Elov16、FASmRNA表達(dá)顯著高于MCFA組、n-3 PUFA組、CON組三組(P＜0.01)

17、。MCFA組肝臟ChREBP mRNA表達(dá)與n-3 PUFA組和CON組相比顯著降低，有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01)。n-3 PUFA組肝臟Elov16 mRNA表達(dá)與MCFA組和CON組相比顯著降低(P＜0.01)。
　　11、LCFA組和n-6 PUFA組脂肪組織LXRα、ChREBP、SREBP-1c、Elov16、FAS mRNA表達(dá)顯著高于MCFA組、n-3 PUFA組、CON組三組(P＜0.01)。MCFA組、n-3 P

18、UFA組、CON組三組，兩兩組間相比無顯著統(tǒng)計學(xué)差異。
　　12、LCFA組和n-6 PUFA組肝臟LXRα蛋白表達(dá)增加，顯著高于MCFA組、n-3PUFA組、CON組三組(P＜0.01)。MCFA組、n-3 PUFA組、CON組三組肝臟LXRα蛋白表達(dá)，兩兩組間相比無顯著統(tǒng)計學(xué)差異。
　　13、LCFA組和n-6 PUFA組肝臟ChREBP蛋白表達(dá)增加，顯著高于MCFA組、n-3 PUFA組、CON組三組(P＜0.01)。

19、MCFA組肝臟ChREBP蛋白表達(dá)與n-3 PUFA組和CON組相比明顯減少，有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01)。n-3 PUFA組與CON組兩組間相比無顯著統(tǒng)計學(xué)差異。
　　14、LCFA組和n-6 PUFA組肝臟Elov16蛋白表達(dá)增加，顯著高于MCFA組、n-3 PUFA組、CON組三組(P＜0.01)。n-3 PUFA組肝臟Elov16蛋白表達(dá)與MCFA組和CON組相比顯著降低，有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01)，MCFA組與CON組

20、兩組間相比無顯著統(tǒng)計學(xué)差異。
　　15、LCFA組和n-6 PUFA組脂肪組織Elov16蛋白表達(dá)增加，顯著高于MCFA、n-3 PUFA、CON三組(P＜0.01)，并且LCFA組和n-6 PUFA組兩組間相比，脂肪組織Elov16蛋白表達(dá)具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01)。MCFA組、n-3 PUFA組、CON組三組，兩兩組間相比無顯著統(tǒng)計學(xué)差異。
　　16、LCFA組和n-6 PUFA組胰島素刺激的IRS2 Ser233位

21、點磷酸化明顯增加，顯著高于MCFA組、n-3 PUFA組、CON組三組(P＜0.01)。MCFA組、n-3 PUFA組、CON組三組Ser233位點磷酸化的IRS2表達(dá)，兩兩組間相比無顯著統(tǒng)計學(xué)差異。各組間總IRS2無明顯差別。
　　17、LCFA組和n-6 PUFA組肝臟Ser473位點磷酸化的Akt明顯減少，顯著低于MCFA組、n-3 PUFA組、CON組三組(P＜0.01)。MCFA組、n-3 PUFA組肝臟Ser473位點

22、磷酸化的Akt較CON組輕度增加，但兩兩組間相比無顯著統(tǒng)計學(xué)差異。各組間總Akt無明顯差別。
　　18、LCFA組脂肪組織Ser473位點磷酸化的Akt明顯減少，顯著低于MCFA組、n-3 PUFA組、n-6 PUFA組和CON組四組(P＜0.01)。n-3 PUFA組脂肪組織Ser473位點磷酸化的Akt明顯增加，與MCFA組、LCFA組、n-6 PUFA組和CON組四組相比有統(tǒng)計學(xué)差異。MCFA組和n-6 PUFA組脂肪組織S

23、er473位點磷酸化的Akt較CON組輕度減少(P＜0.05)，MCFA組和n-6 PUFA兩組間相比無顯著統(tǒng)計學(xué)差異。各組間總Akt無明顯差別。
　　19、CON組肝細(xì)胞排列緊密，邊緣清晰，核大，未見橘紅色脂肪滴。四組高脂高糖飲食組均可見橘紅色脂肪滴。LCFA組和n-6 PUFA組大鼠肝臟均可見大量的橘紅色脂滴，MCFA組大鼠肝臟亦可見較多的橘紅色脂滴，n-3 PUFA組大鼠肝臟可見少許橘紅色脂滴。
　　20、轉(zhuǎn)錄因子LX

24、Rα、SREBP-1c和ChREBP及其靶基因Elov16和FAS mRNA與ISI的相關(guān)性分析。ISI與LXRα mRNA(r=-0.756，p＜0.001)，ChREBP mRNA(r=-0.743,p＜0.001), SREBP-1c mRNA(r=-0.767,p＜0.001), Elov16 mRNA(r=-0.707，p＜0.001)，F(xiàn)AS mRNA(r=-0.594，p＜0.001)，具有顯著的負(fù)相關(guān)。
　　結(jié)論：

25、
　　1、攝入高含量的LCFA和n-6 PUFA，可引起肥胖、脂毒性、高胰島素血癥、高血糖的發(fā)生，誘導(dǎo)大鼠胰島素抵抗。
　　2、攝入高含量的MCFA和n-3 PUFA，可相對拮抗肥胖、脂毒性、高胰島素血癥、高血糖的發(fā)生，改善大鼠胰島素敏感性。
　　3、肝臟和脂肪組織LXRα、ChREBP、Elov16表達(dá)的變化與胰島素抵抗有關(guān)。
　　4、攝入高含量的LCFA和n-6 PUFA飲食可以引起胰島素抵抗，并伴有肝臟和脂