三種常用抗菌藥物對(duì)小鼠腸道大腸埃希菌和腸球菌影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景： 機(jī)會(huì)菌(也稱為機(jī)會(huì)致病菌或條件致病菌)正在越來越多地成為人類疾病的病原菌，特別是醫(yī)院感染的病原菌。除了易位原因造成感染外，機(jī)會(huì)菌數(shù)量的大量增殖且產(chǎn)生耐藥性是其致病的重要原因之一。究其原因，可能與目前抗菌藥物的濫用有關(guān)。目前，臨床上濫用抗菌藥物已經(jīng)成為一種普遍現(xiàn)象。抗菌藥物，特別是廣譜抗菌藥物，不僅能抑制或殺死致病菌，而且也作用于正常菌群?？咕幬锏氖褂檬拐＞褐械囊嫔艿揭种疲⑸鷳B(tài)的平衡發(fā)生改變，條件致病菌大量

2、增殖，有機(jī)會(huì)成為致病菌。 目前，耐藥的機(jī)會(huì)菌，已經(jīng)成為人類目前面臨的一個(gè)重要的臨床和公共衛(wèi)生難題——醫(yī)院感染的主要原兇。 當(dāng)前國(guó)內(nèi)外致醫(yī)院感染的革蘭氏陰性菌中，排第1～2位的是大腸埃希菌，在革蘭氏陽性菌中，排第1～2位的是腸球菌，而且其耐藥率在逐年升高。為何大腸埃希菌和腸球菌會(huì)成為醫(yī)院感染常見的致病菌?大腸埃希菌和腸球菌在常用抗生素的作用下呈何變化規(guī)律?抗菌藥物常規(guī)使用時(shí)間范圍內(nèi)能否誘導(dǎo)其產(chǎn)生耐藥性?目前對(duì)這些問題尚不清

3、楚。 本研究擬采用小鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，模擬臨床的用藥方法，觀察動(dòng)物腸道的大腸埃希菌和腸球菌在常用抗菌藥物的壓力下的變化規(guī)律，為進(jìn)一步深入認(rèn)識(shí)這兩種細(xì)菌成為致病菌的規(guī)律以及耐藥性形成規(guī)律奠定基礎(chǔ)。 為了與臨床實(shí)際相符，本研究選用了三種作用機(jī)理不同的臨床常用的廣譜抗菌藥物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，三種藥物分別是頭孢氨芐(頭孢類)、丁胺卡那霉素(氨基糖甙類)和環(huán)丙沙星(喹諾酮類)。鑒于臨床上抗菌藥物用藥常常采用聯(lián)合用藥方法，為了觀察到聯(lián)合用藥的影響

4、，我們采用了析因設(shè)計(jì)方法進(jìn)行本研究。 目的： 為深入探討機(jī)會(huì)菌感染和耐藥的機(jī)制奠定基礎(chǔ)，另外，對(duì)于指導(dǎo)臨床抗菌藥物的合理使用，預(yù)防和控制醫(yī)院感染也有重要的理論和實(shí)用意義。 方法： 采用3×2析因設(shè)計(jì)，用四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院研制的PEMS3.1軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)。 1處理因素和水平 1.1處理因素 頭孢氨芐、丁胺卡那霉素注射液、環(huán)丙沙星。 1.2處理水平 處理水平分別為

5、：頭孢氨芐(0mg/kg，500mg/kg)、丁胺卡那霉素注射液(0mg/kg，200mg/kg)、環(huán)丙沙星(0mg/kg，150mg/kg)。 2實(shí)驗(yàn)對(duì)象分組：將48只昆明小鼠隨機(jī)分為8組，每組6只。分別是： 2.1第一組：不給抗菌藥物，給予生理鹽水 2.2第二組：環(huán)丙沙星給藥組 2.3第三組：丁胺卡那霉素給藥組 2.4第四組：環(huán)丙沙星和丁胺卡那霉素聯(lián)合用藥組 2.5第五組：頭孢氨芐給藥

6、組 2.6第六組：頭孢氨芐和環(huán)丙沙星聯(lián)合用藥組 2.7第七組：頭孢氨芐和丁胺卡那霉素聯(lián)合用藥組 2.8第八組：頭孢氨芐、環(huán)丙沙星和丁胺卡那霉素聯(lián)合用藥組 3小鼠一般表現(xiàn)觀察 3.1觀察時(shí)間：給藥14d期間及停藥后14d。 3.2觀察內(nèi)容：觀察小鼠的活動(dòng)情況、外觀如毛發(fā)、食欲、有無腹瀉以及其它反應(yīng)。 4實(shí)驗(yàn)方法 4.1給藥方法 頭孢氨芐按500mg/kg的劑量灌胃，每

7、天兩次；丁胺卡那霉素為注射劑，按200mg/kg的劑量經(jīng)大腿肌肉注射，每天兩次；環(huán)丙沙星按150mg/kg的劑量灌胃，每天兩次。未給藥組給予生理鹽水。分別給藥14天。 4.2標(biāo)本收集 分別于給藥第0、2、4、6、8、10、12和14天及停藥后第2、4、6、8、10、12和14天收集小鼠糞便標(biāo)本0.01g于1ml稀釋液中。 4.3檢測(cè)方法：采用涂片法和細(xì)菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)法觀察腸道菌群變化。 將采集的小鼠新鮮糞便0

8、.01g稀釋于1ml稀釋液中，混勻后，在載玻片上涂成厚薄均勻的薄膜，自然干燥后酒精燈火焰固定，革蘭氏染色。用EMB、EC、BS、LBS分別培養(yǎng)腸桿菌、腸球菌、雙歧桿菌和乳桿菌等腸道細(xì)菌，用麥康凱培養(yǎng)基作分離培養(yǎng)，再用KIA培養(yǎng)基純化可疑菌落，用微生物生化鑒定管檢測(cè)糞便細(xì)菌。 5藥敏試驗(yàn) 將不同實(shí)驗(yàn)階段分離的大腸埃希菌和腸球菌用紙片法作藥物敏感試驗(yàn)。對(duì)給藥第0、6、14天及停藥后第8天分離出的大腸埃希菌和腸球菌分別作頭孢噻

9、肟(CTX)、阿米卡星(AK)、環(huán)丙沙星(CIP)、頭孢唑林(KZ)、青霉素(P)等5種藥敏紙片的藥敏試驗(yàn)。 結(jié)果： 1小鼠的一般表現(xiàn) 不給藥組的小鼠未見異常表現(xiàn)。給藥組給藥2～3天后，小鼠可出現(xiàn)便秘，給藥4～6d后各組分別有1～3只小鼠出現(xiàn)不同程度腹瀉；有2～4只小鼠活動(dòng)減少、表現(xiàn)較萎靡、毛發(fā)豎起；第4組和第6組分別有一只動(dòng)物死亡。停藥后2～4d上述表現(xiàn)基本消失，停藥6d后小鼠全部恢復(fù)正常表現(xiàn)。 2糞便

10、涂片結(jié)果 給藥前各組和不給藥組(第1組)小鼠糞便涂片革蘭氏染色結(jié)果呈現(xiàn)桿菌為優(yōu)勢(shì)菌，尤以G-桿菌居多，其次為G+桿菌和G+球菌，僅見少量G-球菌。不給藥組觀察期間沒有明顯變化；各給藥組給藥后第2天和第4天G-桿菌和G+球菌均急劇下降，然后G-桿菌緩慢上升，G+球菌則迅速上升成為優(yōu)勢(shì)菌，至14d涂片結(jié)果基本恢復(fù)原來狀態(tài)。停藥后，糞便涂片結(jié)果大體上G-和G+菌都呈現(xiàn)先降后升的變化，涂片結(jié)果除第2組恢復(fù)原來狀態(tài)需10d左右，其余各組均

11、在停藥后6～8d恢復(fù)。 3糞便細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果 3.1給藥后，小鼠糞便大腸埃希菌與腸球菌呈現(xiàn)不同的變化規(guī)律。大腸埃希菌數(shù)量呈先降后升，而腸球菌則表現(xiàn)為先升后降的變化規(guī)律。 3.2藥物作用6d，三種藥物均導(dǎo)致小鼠腸道大腸埃希菌數(shù)量顯著減少(P＜0.05)，而腸球菌數(shù)量增加(P＜0.05)。三種藥物單獨(dú)用藥對(duì)于乳酸桿菌和雙歧桿菌的數(shù)量無明顯影響(P＞0.05)。 3.3藥物作用14d，大腸埃希菌數(shù)回升，有些組別數(shù)

12、量甚至高于實(shí)驗(yàn)前，而腸球菌數(shù)則顯著減少。 3.4三種藥物的交互效應(yīng)：藥物作用6d，對(duì)大腸埃希菌的影響方面，頭孢氨芐和環(huán)丙沙星聯(lián)合作用有拮抗作用；頭孢氨芐和丁胺卡那霉素，環(huán)丙沙星和丁胺卡那霉素則有協(xié)同作用；頭孢氨芐、丁胺卡那霉素和環(huán)丙沙星三者聯(lián)合使用有協(xié)同作用。對(duì)腸球菌的影響方面，三者抗菌藥物之間交互效應(yīng)有協(xié)同作用。藥物作用14d，僅丁胺卡那霉素與環(huán)丙沙星之間對(duì)腸球菌作用的交互效應(yīng)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩者有協(xié)同作用。 4耐藥性檢

13、測(cè)的情況 大腸埃希菌和腸球菌對(duì)P和KZ均不敏感。AK、CIP、CTX對(duì)兩種菌的敏感性不同。 4.1大腸埃希菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果 藥物作用6天，與給藥前相比，藥敏試驗(yàn)結(jié)果無明顯變化。藥物作用14d后，大腸埃希菌對(duì)AK、CIP和CTX抑菌圈直徑下降。停藥8d后，抑菌圈直徑回升。 4.2腸球菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果 腸球菌對(duì)AK、CIP和CTX給藥前后均敏感，抑菌圈直徑無明顯變化。 結(jié)論： 1使用廣譜抗

14、菌藥物可致小鼠腸道菌群失調(diào) 頭孢氨芐、丁胺卡那霉素和環(huán)丙沙星三種廣譜抗菌藥物均可對(duì)小鼠造成腸道菌群失調(diào)。尤其是環(huán)丙沙星導(dǎo)致的菌群失調(diào)持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)。三種抗菌藥物之間兩兩聯(lián)合或三者聯(lián)合作用有交互作用。失調(diào)的主要表現(xiàn)為G+菌與G-菌比例以及桿菌與球菌比例的改變，分離鑒定表明主要是大腸埃希菌和腸球菌數(shù)量的變化。在本實(shí)驗(yàn)條件下，雙歧桿菌和雙岐桿菌等菌未看出明顯變化。 2小鼠腸道大腸埃希菌和腸球菌數(shù)量的變化特點(diǎn)不同 抗菌藥物