初治非小細(xì)胞肺癌患者肺原發(fā)灶EGFR基因突變狀態(tài)與其臨床病理特征的相關(guān)性研究.pdf

1、肺癌是全世界癌癥相關(guān)死亡的第一原因,而肺癌中大約80％是非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC),晚期NSCLC患者的5年生存時間小于15%。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)是第一個于非小細(xì)胞肺癌中篩選出的重要驅(qū)動基因,腫瘤細(xì)胞根據(jù)“EGFR通路”進(jìn)行繁殖、增長與侵襲轉(zhuǎn)移等生物學(xué)相關(guān)行為。多項III期臨床試驗研究證明,三磷酸腺苷(Ass

2、ociation Tennis Professional,ATP)競爭性酪氨酸激酶抑制劑(Tyrosine Kinase Inhibitors,TKIs)已成為NSCLC患者伴有EGFR酪氨酸激酶區(qū)21與19外顯子激活突變臨床選擇治療的一線治療方案。目前市場上EGFR-TKIs藥物主要有?？颂婺?、吉非替尼和厄羅替尼等。EGFR-TKIs具有抑制癌細(xì)胞生長、血管生成和侵襲轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為,其主要通過競爭細(xì)胞內(nèi)EGFR酪氨酸蛋白激酶區(qū)域的A

3、TP結(jié)合部位,可逆性阻礙EGFR酪氨酸激酶的激活,達(dá)到抑制癌癥生長的作用。腫瘤組織標(biāo)本來源的DNA結(jié)合直接測序法已成為EGFR基因突變檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”。進(jìn)行EGFR基因突變檢測需要獲取滿意的組織標(biāo)本,但是臨床實踐中腫瘤組織樣本的獲得受到很多因素的限制,很多患者不能取得滿意的組織樣本進(jìn)行EGFR基因突變檢測。已有大量研究探討利用患者外周血游離DNA替代組織標(biāo)本來源的DNA檢測EGFR基因突變的可能性。但是不同標(biāo)本來源DNA中EGFR基因突

4、變檢測結(jié)果的一致性尚未明確。因此,本研究利用卡方檢驗法分析晚期NSCLC患者外周中EGFR基因突變與組織標(biāo)本中EGFR基因突變結(jié)果的一致性,旨在探討利用患者外周血游離DNA代替組織標(biāo)本DNA檢測EGFR基因突變的可靠性,以及分析其與臨床病理基線的相關(guān)性,為不能進(jìn)行組織EGFR突變檢測的患者使用分子靶向治療提供證據(jù)。本課題的第二部分采用卡方檢驗分析初治NSCLC患者肺原發(fā)灶組織樣本EGFR基因突變情況,及其與患者的臨床病理資料指標(biāo)的關(guān)聯(lián)性

5、。以此來探討可預(yù)測組織樣本中EGFR基因突變的臨床指標(biāo),以期達(dá)到利用臨床指標(biāo)取代組織標(biāo)本EGFR基因突變檢測可能性,對于部分難以獲取腫瘤組織標(biāo)本進(jìn)行EGFR基因突變檢測的患者,利用臨床指標(biāo)篩選出對TKIs治療效果較好的有利人群,為臨床實現(xiàn)TKIs診療提供一定的理論證據(jù)。約有25%-54%NSCLC患者在腫瘤細(xì)胞進(jìn)展階段會發(fā)生腦轉(zhuǎn)移。有研究表明NSCLC腦轉(zhuǎn)移發(fā)生可能與其EGFR突變相關(guān),但NSCLC腦轉(zhuǎn)移對肺原發(fā)灶EGFR突變的預(yù)測作用

6、,目前尚無報道。因此,本研究最后擬通過臨床樣本和離體實驗進(jìn)一步探討NSCLC腦轉(zhuǎn)移與肺原發(fā)灶EGFR突變的關(guān)聯(lián)性,利用NSCLC腦轉(zhuǎn)移預(yù)測肺原發(fā)灶EGFR基因突變狀況,為未能進(jìn)行EGFR突變檢測伴有腦轉(zhuǎn)移的NSCLC患者使用EGFR-TKIs治療提供一定的證據(jù),為篩選EGFR-TKIs治療有效的優(yōu)勢人群提供理論依據(jù)。
　　研究目的:
　　1.探討NSCLC患者外周血來源的游離DNA中EGFR激活突變與石蠟組織配對樣本來源DN

7、A中EGFR基因突變檢測結(jié)果的一致性,旨在探討利用患者外周血游離DNA代替組織標(biāo)本DNA檢測EGFR基因突變的可靠性,外周血EGFR基因突變與患者臨床特征的關(guān)聯(lián)性,為不能進(jìn)行組織EGFR突變檢測的患者使用分子靶向治療提供證據(jù)。
　　2.研究初治NSCLC患者肺原發(fā)灶組織樣本EGFR基因突變狀況,及其與患者臨床病理資料指標(biāo)的相關(guān)性,利用臨床指標(biāo)代替EGFR基因突變檢測,從未能進(jìn)行EGFR基因突變檢測的初治NSCLC患者中篩選出使用分

8、子靶向治療效果較好的有利人群,為實現(xiàn)患者個體化TKIs治療提供一定的理論依據(jù)。
　　研究伴有腦轉(zhuǎn)移初治NSCLC患者特有的臨床特征與肺原發(fā)灶組織樣本EGFR基因突變的相關(guān)性,從未能進(jìn)行EGFR基因突變檢測且伴有腦轉(zhuǎn)移的初治NSCLC患者中篩選出對分子靶向治療治療有效的有利人群。
　　3.研究NSCLC患者發(fā)生腦轉(zhuǎn)移對肺原發(fā)灶組織樣本EGFR基因突變的相關(guān)性,利用NSCLC腦轉(zhuǎn)移預(yù)測肺原發(fā)灶EGFR基因突變狀況,為未能進(jìn)行EG

9、FR基因檢測且伴有腦轉(zhuǎn)移的NSCLC患者采納TKIs治療提供一定的證據(jù)。
　　研究方法與內(nèi)容:
　　1. NSCLC患者血漿與組織樣本中EGFR基因突變狀況的比較
　　收集第三軍醫(yī)大學(xué)附屬大坪醫(yī)院腫瘤中心2011年6月至2013年12月446例經(jīng)病理確診為非小細(xì)胞肺癌患者的臨床資料。采用DHPLC技術(shù)檢測446例患者外周血中EGFR基因突變,Sanger直接測序技術(shù)檢測從446例中篩選出40例配對組織標(biāo)本EGFR基因突

10、變。卡方檢驗分析血漿與組織中EGFR基因突變的一致性及其與患者臨床特征的關(guān)系。
　　2.初治NSCLC患者肺原發(fā)灶EGFR基因突變狀態(tài)與其臨床病理特征的相關(guān)性研究
　　收集2011年7月至2013年5月第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院腫瘤中心253例初次就診的NSCLC臨床病理資料。使用ARMS法(人類EGFR基因突變熒光PCR檢測試劑盒)檢測253例患者的肺原發(fā)灶組織樣本EGFR基因突變。并用X2方法分析肺原發(fā)灶EGFR基因突變狀

11、態(tài)及其與253例NSCLC患者臨床特征之間的關(guān)聯(lián)性。
　　253例初治NSCLC中有31例出現(xiàn)腦轉(zhuǎn)移,收集腦轉(zhuǎn)移灶特有的臨床資料,運用卡方檢驗方法分析肺原發(fā)腫瘤 EGFR基因突變與患者腦轉(zhuǎn)移患者特有的臨床特征之間的關(guān)系。
　　3.NSCLC腦轉(zhuǎn)移與肺原發(fā)灶EGFR基因突變狀況的相關(guān)研究
　　顯微鏡觀察EGFR基因野生型A549人肺腺癌細(xì)胞與EGFR基因19外顯子缺失突變型HCC827細(xì)胞形態(tài)學(xué)差異;采用MTT方法比較A

12、549與HCC827細(xì)胞增殖差異;應(yīng)用細(xì)胞體外侵襲實驗Transwell技術(shù)判斷兩株細(xì)胞侵襲水平的高低。
　　4.所有EGFR基因突變與臨床基線之間的關(guān)系應(yīng)用卡方檢驗(Chi-square tsst,X2)檢驗或Fisher確切概率法以及Logistic回歸分析。P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。所有分析用SPSS16.0軟件包完成。兩種不同細(xì)胞株MTT OD值、兩種細(xì)胞侵襲個數(shù)、兩種細(xì)胞遷移數(shù)目的比較采用one-way AOVA分析。

13、
　　研究結(jié)果:
　　1.NSCLC患者血漿與組織樣本中EGFR基因突變狀況的比較
　　446例血漿總樣本與40例組織樣本中EGFR基因突變率各為19.7%,37.5%兩者之間有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.003)。40例血漿與組織配對樣本EGFR基因突變對比分析中,若以組織樣本EGFR基因突變?yōu)闃?biāo)準(zhǔn),則外周血中游離DNA中EGFR活化突變的各個檢測指標(biāo):陰性預(yù)測值、陽性預(yù)測值、靈敏度、特異性分別為76.7%(23/30)、8

14、0.0%(8/10)、53.3%(8/15)、92.0%(23/25)。
　　446例血漿樣本EGFR基因突變和其臨床特征的關(guān)聯(lián)性顯示:女性的突變率高于男性,腺癌的突變率高于非腺癌者,但是兩者無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.148,P=0.262)。
　　2.初治NSCLC患者肺原發(fā)灶EGFR基因突變狀態(tài)與其臨床病理特征的相關(guān)性研究253例初治NSCLC患者的EGFR基因突變檢測結(jié)果中主要有以下4種類型19Del、21L861Q、21

15、L858R、20Ins即外顯子19號上的缺失突變、外顯子21號的替代突變以及點突變、外顯子20號上的插入突變。109例是突變型,144例是野生型,各自的比例為43.1%(109/253),56.9%(144/253)。
　　敏感型EGFR基因突變在初次就診的253例NSCLC患者中的發(fā)生率為42.%(107/253),其中EGFR基因(21L861Q)21外顯子替代突變發(fā)生率與和(21L858R)21外顯子點突變發(fā)生率為39.1%

16、(32/107)、19外顯子缺失突變發(fā)生率為70.1%(75/107)。(20Ins)20外顯子插入突變?yōu)門KIs耐藥性突變,其突變發(fā)生率為0.8%(2/253)。肺原發(fā)灶EGFR基因敏感型突變中男性與女性突變率之比為25.8%(41/61)vs70.2%(66/94);有吸煙史與無吸煙史者突變率之比為18.1%(19/105) vs60.9%(81/133);非腺癌與腺癌者突變率之比為8.5%(4/47)vs50.0%(103/206

17、),兩者有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　253例非小細(xì)胞肺癌中,31例患者出現(xiàn)腦轉(zhuǎn)移,其轉(zhuǎn)移率為12.3%(31/253)109例肺原發(fā)灶EGFR基因為突變型中有8例發(fā)生了腦轉(zhuǎn)移,在腦轉(zhuǎn)移患者中的突變率為25.81%(8/31)。其中19號外顯子的突變率為22.6%(7/31),21號外顯子的突變率為3.2%(1/31)。而19外顯子與21號外顯子突變在總的8例腦轉(zhuǎn)移突變型中所占的比例分別為87.5%(7/8),12.5%(1

18、/8)。分析EGFR基因突變與腦轉(zhuǎn)移預(yù)后評估系統(tǒng)中的年齡、KPS評分、腦轉(zhuǎn)移個數(shù)、肺原發(fā)灶控制與否及有無腦外轉(zhuǎn)移臨床特征之間的關(guān)系,結(jié)果顯示兩者之間無顯著的相關(guān)性(P>0.05)
　　3.NSCLC腦轉(zhuǎn)移與肺原發(fā)灶EGFR基因突變狀況的相關(guān)研究
　　MTT法實驗比較EGFR野生型A549細(xì)胞與EGFR突變型HCC827細(xì)胞的增殖差異,前者比后者增殖快,兩者有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05%)。比較細(xì)胞A549與HCC827細(xì)胞的侵

19、襲能力強(qiáng)弱,我們采用Transwell方法發(fā)現(xiàn)前者弱于后者(P<0.05)。253例NSCLC患者腦轉(zhuǎn)移發(fā)生率為12.3%(31/253),其中8例有肺原發(fā)灶EGFR基因突變,突變率僅25.81%(8/31),發(fā)生腦轉(zhuǎn)移與肺原發(fā)灶突變無明顯相關(guān)性。
　　結(jié)論:
　　1.血漿樣本代替組織樣本進(jìn)行EGFR基因檢測具有一定的應(yīng)用價值,但其靈敏度較低,存在假陰性。
　　2.女性、腺癌、不吸煙的初治NSCLC患者原發(fā)灶易出現(xiàn)EG